Vibrio sp.FG1瓊膠酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張力雄，劉明明，方再光

瓊膠是一種特殊的海藻多糖，可從石花菜等紅藻類植物中提取出來，是海洋紅藻類植物細(xì)胞壁的一種粘性多糖，由于其獨(dú)特的凝固性和穩(wěn)定性等優(yōu)良性質(zhì)使其極具經(jīng)濟(jì)價值［1］.瓊膠酶是一種糖苷水解酶（GH）類，能夠特異性降解瓊膠，其水解產(chǎn)物是瓊膠寡糖［2］.根據(jù)作用方式的不同可以把瓊膠酶分為兩類：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶［3］.瓊膠酶產(chǎn)生菌的來源有海水、海洋軟體動物、海洋沉積物、土壤及海藻等，海洋環(huán)境成為其最主要來源［4］.目前，已報道多種瓊膠酶產(chǎn)生菌，包括假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）［5］、交替單胞菌屬（Al?teromonas sp.）［6］、噬纖維菌屬（Cytophaga sp.）［7］、弧菌屬（Vibrio sp.）［8］、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）［9］、噬瓊膠菌屬（Agarivorans sp.）［10］和 類 芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）［11］等.

瓊脂的降解產(chǎn)物瓊寡糖和新瓊寡糖在食品、保健品、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、生物實(shí)驗中的應(yīng)用前景廣泛，一方面使海藻具有免疫防御和誘導(dǎo)抗逆性的作用；另一方面使動物具有體內(nèi)抗氧化、抗紫外線、提高保鮮度的作用，并改善人類腸道微生物菌群、促進(jìn)益生元.探究瓊膠降解菌發(fā)酵工藝、瓊膠酶分離純化方法，以及重組酶高表達(dá)載體構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)瓊寡糖產(chǎn)業(yè)化的重點(diǎn).本實(shí)驗通過發(fā)酵、超濾濃縮、透析、凝膠柱層析對瓊膠酶FG1進(jìn)行分離純化，并優(yōu)化酶解反應(yīng)條件，為日后高純度瓊膠酶的制備以及瓊膠酶分子結(jié)構(gòu)的研究和瓊膠寡糖的大量制備奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株.本實(shí)驗室從海南陵水熱帶海洋環(huán)境中分離篩選出菌株FG1.

（2）培養(yǎng)基.X培養(yǎng)基（優(yōu)化后的2216E海水培養(yǎng)基［12-14］）：0.5%蛋白胨，0.1%酵母粉，0.1% K2HPO4·3H2O，0.05% KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.01% FeSO4·7H2O，0.5%~1.5%瓊 膠，pH 7.21~7.25.121℃、20 min高溫高壓滅菌后待用.固體培養(yǎng)基中瓊脂粉含量為1.2%.

（3）試劑與儀器.細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；質(zhì)粒pMD19-T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自大連寶生物有限公司；凝膠顆粒Sephadex G-100購自南京森貝伽生物科技有限公司；蛋白質(zhì)電泳marker購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；GL-802A型微型臺式真空泵購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HL-2恒流泵購自上海青浦滬西儀器廠；HD-3紫外檢測儀購自上海和勤分析儀器有限公司.

1.2 FG1菌株粗酶液的制備

去適量活化后的菌株接種到含0.5%瓊脂的X固體培養(yǎng)基（含鏈霉素）中，置于28℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min，36 h后收集發(fā)酵液，12 000 r/min、4℃離心15 min，棄沉淀，取上清.超濾濃縮并透析后得到粗酶液.吸取10μL粗酶液滴于瓊脂（僅含1.5%瓊脂，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）培養(yǎng)基表面，封口置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)3~5 h，用盧戈氏碘液染色，觀察結(jié)果.若出現(xiàn)透明圈，則證明該酶液具有瓊膠酶活力.

1.3 Native-PAGE電泳

分別制備Native-PAGE蛋白電泳膠與SDS-PAGE蛋白電泳膠，每組制備兩塊膠作為平行實(shí)驗.點(diǎn)樣后接上電泳儀，將電壓調(diào)至80 V，待溴酚藍(lán)移動至濃縮膠與分離膠的界限處，更改電壓至120 V，直至溴酚藍(lán)移出分離膠.將Native-PAGE分離膠切下，一塊膠平鋪于瓊脂培養(yǎng)基（1.5%瓊脂，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)3~5 h，用盧戈氏碘液染色，觀察結(jié)果.另一塊膠用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果.

1.4 葡聚糖凝膠柱層析

本實(shí)驗選用Sephadex G-100作為層析介質(zhì)，根據(jù)柱型稱取適量干粉浸泡于乙醇中，攪拌均勻放置24 h.再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，再以緩沖液A洗滌2~3次，使用真空抽濾抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡.之后裝柱過夜沉降后加入FG1粗酶液并收集各組分.將收集到的組分同時進(jìn)行Native-PAGE電泳與SDS-PAGE電泳后染色并脫色觀察.

1.5 FG1粗酶液的酶活測定

（1）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.按照表1添加試劑，煮沸10 min，待冷卻后加入4 mL雙蒸水.用紫外分光光度計測定540 nm下的吸光度.

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑表

（2）測定FG1粗酶液酶活.以反應(yīng)產(chǎn)物還原糖的含量作為檢測瓊膠酶活力的指標(biāo).取100μL粗酶液至100 mL加熱溶解的含0.3%瓊脂20 mmol/L PBS緩沖體系（pH=7.4）培養(yǎng)基中，于37℃恒溫震蕩箱中反應(yīng)10 min.10 000 r/min、4℃離心10 min.取0.5 mL上清液與0.5 mL DNS試劑混合，煮沸10 min，冷卻后加入4 mL雙蒸水，在540 nm波長下測其OD值，重復(fù)3次，以滅活酶液作對照.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量.

相對酶活力（%）：每一酶解反應(yīng)影響因素下，各因素水平酶液的酶活力與最高反應(yīng)因素水平酶液酶活力的百分比［12］.

1.6 FG1瓊膠酶的酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)本實(shí)驗前期研究，已知FG1瓊膠酶酶促反應(yīng)的最佳緩沖體系為20 mmol/L PBS緩沖液.本實(shí)驗主要進(jìn)行底物濃度、pH、溫度三個影響因素的優(yōu)化.酶液加樣量均為1%.

（1）底物濃度對酶促反應(yīng)的影響.將培養(yǎng)基中的瓊脂濃度配制為：0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%.溫度控制為37℃，pH控制為7.4.酶解反應(yīng)30 min后測上清液中的酶活力.

（2）pH對酶促反應(yīng)的影響.配制初始pH分別為：6.00、6.40、6.90、7.40、7.60、7.80、8.00、8.20、8.40、8.60，溫度控制為37℃，底物濃度控制為0.3%.酶解反應(yīng)30 min后測上清液中的酶活力.

（3）溫度對酶促反應(yīng)的影響.根據(jù)大多數(shù)瓊膠酶反應(yīng)溫度的經(jīng)驗值設(shè)定溫度梯度為：27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃、57℃，pH控制為7.4，底物濃度控制為0.3%.酶解反應(yīng)30 min后測上清液中的酶活力.

（4）酶促反應(yīng)條件的正交設(shè)計.單因素實(shí)驗結(jié)束后，根據(jù)每個因素的最佳值設(shè)計三個水平，運(yùn)用正交表進(jìn)行實(shí)驗，每組取三個重復(fù)值.

2 結(jié)果分析

本實(shí)驗室前期對FG1菌株進(jìn)行了16s rDNA鑒定，結(jié)果為vibrio.sp.其16s序列信息已收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫中，編碼為KU362877.

2.1 FG1菌株粗酶液制備及酶活檢測

結(jié)果如圖1所示，經(jīng)染色后的反應(yīng)體系中出現(xiàn)透明光圈，表明提取的粗酶液具有瓊膠酶活性.

圖1 瓊膠酶的活性檢測結(jié)果

2.2 粗酶液Native-PAGE電泳結(jié)果

將FG1粗酶液進(jìn)行Native-PAGE電泳.電泳后，將分離膠切下，一塊膠鋪于瓊膠培養(yǎng)基表面反應(yīng)并用盧戈氏碘液染色，另一塊膠用于考馬斯亮藍(lán)染色，染色結(jié)果如圖2.由該圖可知，在發(fā)酵液上清液經(jīng)超濾濃縮、透析后獲得的所有蛋白成分中含有3種瓊膠酶，并且在染色后的瓊膠薄膜中呈現(xiàn)出了比較明顯的水解帶.

圖2 Native-PAGE與碘液染色結(jié)果

2.3 葡聚糖凝膠柱層析純化結(jié)果

棄去一個柱床體積的洗脫液之后開始收集樣品，根據(jù)紫外檢測儀示數(shù)的變化分開收集每個不同示數(shù)的洗脫液，共收集45管洗脫液并進(jìn)行活性測定，結(jié)果如圖3所示.

圖3 葡聚糖凝膠柱層析純化產(chǎn)物活性檢測結(jié)果

根據(jù)紫外檢測結(jié)果可知，21號管之后無蛋白峰存在，45管洗脫液從1號到45號分成3組，1~9號為一組、10~18號為一組、21號與后續(xù)27號、33號、39號為一 組，分別滴加到3個瓊脂培養(yǎng)基上反應(yīng)，210 min后盧戈氏碘液染色.結(jié)果表明，從第2號收集管到21號收集管均檢測到瓊膠酶活性.

紫外檢測儀檢測到兩個峰值，故可推測FG1瓊膠酶粗酶液中至少含有兩種瓊膠酶，命名為酶組分A和酶組分B.

對酶組分A和酶組分B進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，結(jié)果如圖4所示，酶組分B純化效果較酶組分A明顯.對比酶組分A與酶組分B的相對遷移距離與蛋白質(zhì)marker的相對遷移距離，計算得到兩個組分中三種瓊膠酶的分子量為：53.45 kD、46.85 kD、42.50 kD.

圖4 SDS-PAGE結(jié)果

將兩種酶液分別進(jìn)行Native-PAGE電泳，結(jié)果如圖5所示.酶組分A中存在兩個分子量非常接近的瓊膠酶，酶組分B中只含一種瓊膠酶.

圖5 各組分Native-PAGE與碘液染色結(jié)果

2.4 FG1瓊膠酶B的活力測定結(jié)果

取100μL粗酶液B加入到100 mL加熱溶解的瓊脂培養(yǎng)基中，置于37℃震蕩培養(yǎng)30 min，測定其上清液OD值為0.421，計算得到其酶活為25.94 U/mL.在同樣條件下，組分B稀釋10倍，測組分B反應(yīng)上清液OD值為0.325，計算得到其酶活為198.48 U/mL，純化了7.65倍，如圖6所示.

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 FG1瓊膠酶B的酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

由圖7可以看出在單因素條件下，F(xiàn)G1瓊膠酶B的最適條件分別為溫度32℃、pH 6.9、底物濃度0.35%.分別對溫度、pH、底物濃度單因素實(shí)驗結(jié)果分析，利用3因素3水平正交表設(shè)計9個實(shí)驗組（表2），每組重復(fù)3次，進(jìn)行酶活測定，計算相對酶活力.正交試驗后，這3個因素的最佳組合為溫度37℃、pH 6.4、底物濃度0.35%，酶活力319.23 U/mL，提高了1.61倍.

圖7 各單因素條件對酶活力的影響

表2 正交設(shè)計實(shí)驗數(shù)據(jù)表

本實(shí)驗同時利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制了響應(yīng)面分析圖及其對應(yīng)的等高線圖，如圖8所示，可直觀地看出各因素之間交互作用的強(qiáng)弱，預(yù)測最佳條件為：溫度38.21℃、pH 7.05、底物濃度0.45%.在隨后的驗證實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，該組條件下的酶活力為312.43 U/mL，略小于正交實(shí)驗結(jié)果，故最終采取正交實(shí)驗所得優(yōu)化后條件.

圖8 響應(yīng)面及等高線圖

3 討論

本實(shí)驗研究材料為FG1瓊膠酶，根據(jù)先前的實(shí)驗［13-14］得知，此類瓊膠酶為胞外酶，發(fā)酵上清液中的雜蛋白相對菌體抽提液較少.通過葡聚糖凝膠柱層析將FG1瓊膠酶分成了酶組分A和酶組分B，電泳結(jié)果顯示，酶組分A仍含有兩種瓊膠酶，分子量分別為53.45 kD和46.85 kD，沒有達(dá)到理想的純化效果，因此還需對FG1瓊膠酶組分A進(jìn)行進(jìn)一步純化；在對FG1瓊膠酶組分B進(jìn)行單因素酶促反應(yīng)實(shí)驗時發(fā)現(xiàn)其有噬酸傾向，遂進(jìn)行了補(bǔ)加初始pH 4.2～pH 5.8條件組，配置培養(yǎng)基時發(fā)現(xiàn)以瓊膠為唯一碳源的培養(yǎng)基均發(fā)生了不同程度的液化現(xiàn)象，在初始pH為5.8的條件下，培養(yǎng)基液化現(xiàn)象基本不明顯，測得酶活小于初始pH為6.0時的酶活，固初步判斷單因素條件下其最適pH為6.9左右，輕微噬酸.

本實(shí)驗利用瓊膠降解菌株FG1分離純化獲得了分子量大小分別為53.45 kD、46.85 kD和42.50 kD三種瓊膠酶.根據(jù)以往研究報道，同一種菌株可產(chǎn)生兩種分子量不同的瓊膠酶.朱啟忠等從海洋細(xì)菌NBRC 102603中得到兩種分子量不同的瓊膠酶［15］、解卉等從海洋細(xì)菌QM38中得到兩種分子量不同的瓊膠酶［16］.少量研究發(fā)現(xiàn)從同一菌株中得到三種及以上分子量不同的瓊膠酶，本實(shí)驗研究結(jié)果也進(jìn)一步驗證了瓊膠酶的多樣性.

4 結(jié)論

本實(shí)驗通過葡聚糖凝膠柱層析將FG1瓊膠酶分成了酶組分A和酶組分B，電泳結(jié)果顯示，酶組分A仍含有兩種瓊膠酶，分子量分別為53.45 kD和46.85 kD，沒有達(dá)到理想的純化效果，酶組分B只含有一種瓊膠酶，分子量為42.50 kD，純化效果更好.經(jīng)超濾濃縮、葡聚糖凝膠柱層析，組分B純化了7.65倍.

同時，本實(shí)驗還探究了溫度、pH、底物濃度對較單一組分瓊膠酶B酶促反應(yīng)的影響.最適反應(yīng)溫度為37℃，與目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)瓊膠酶相似.最適初始pH為6.9，偏酸性，低于大多數(shù)瓊膠酶pH范圍，當(dāng)pH超過8.6，幾乎不能降解瓊脂.最適底物濃度為0.35%，偏向于半固態(tài)瓊脂.正交試驗后，這三個因素的最佳組合為：溫度37℃、pH 6.4、底物濃度0.35%，酶活力提高到1.61倍.但是相較于本實(shí)驗室保存的其他瓊膠降解菌的瓊膠酶，本實(shí)驗瓊膠酶酶活依舊偏低，因此還有待于對FG1所產(chǎn)瓊膠酶組分進(jìn)一步分離純化，為瓊膠酶的分離純化以及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).