飼料添加L-精氨酸或N-氨甲酰谷氨酸對黃顙魚生長、腸道功能、血清生化指標和抗氨氮應激能力的影響

趙紅霞 喬國賢,2 李培佳 陳曉瑛,3 陳 冰 黃 文* 曹俊明*

(1.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.華中農業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢 430070；3.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640)

高密度養(yǎng)殖、飼料過量投喂、水體更換少和飼料營養(yǎng)不平衡等是集約化養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮濃度升高的主要因素[1-2]。養(yǎng)殖水體中氨濃度的上升易導致水生動物的低存活率、代謝變化、氧化應激、免疫抑制和疾病[3-5]。因此，如何通過營養(yǎng)措施調控魚蝦免疫和抗病力受到廣泛關注。精氨酸(Arg)作為底物參與一氧化氮、蛋白質和多胺的合成，并發(fā)揮重要的生物和生理功能，有助于增強動物機體的健康和促進發(fā)育。有研究表明，Arg能夠提高養(yǎng)殖動物生產(chǎn)性能、調控蛋白質合成和信號轉導、通過一氧化氮途徑修復創(chuàng)傷、抑制炎癥細胞因子表達、緩解氧化應激反應[6-9]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)是N-乙酰谷氨酸(NAG)的類似物，在動物體內能夠作為前體物質合成Arg[10]。NCG是一種安全、代謝穩(wěn)定的營養(yǎng)物質，在臨床中對治療一些與健康有關的疾病具有有益作用[11]。補充NCG可以刺激內源性Arg和瓜氨酸產(chǎn)生、促進肌肉蛋白質合成、提高生產(chǎn)性能和生長速度、調控信號通路和改變血漿Arg含量[12-14]。目前，NCG在水生動物方面的研究報道[15-19]較少。Arg和NCG對魚類生長、腸道功能和免疫抗氧化方面的不同影響及作用差異尚未有見報道。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，雜食性溫水魚類。黃顙魚分布范圍廣，除西部高原外，全國各水域均有分布。近年來，隨著我國黃顙魚規(guī)模化養(yǎng)殖不斷增加，有關其健康狀況和病害防治方面的研究也在不斷加強。本實驗室前期研究顯示，黃顙魚飼料中Arg的適宜添加水平為2.64%～3.01%，NCG的適宜添加水平為0.025%[19-20]，在此基礎上，本試驗通過在飼料中添加Arg和NCG，研究Arg和NCG對黃顙魚幼魚生長、腸道健康、血清生化指標和抗氨氮應激能力的影響，比較Arg和NCG對黃顙魚的作用效果，為Arg及NCG在黃顙魚配合飼料中的應用提供相關的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎飼料中分別添加0(對照)、0.48%L-Arg(純度≥99%，購自寧波某氨基酸工業(yè)有限公司)、0.025% NCG(純度≥98%，購自某科技有限公司)，配制3種等氮等脂(42%蛋白質和7%脂肪)試驗飼料[20]。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料粉碎后過60目篩，按照飼料配方要求準確稱量，并逐級混勻后，加入魚油、豆油和30%的水，再次混合均勻后，用雙螺桿制粒機(SLX-80，華南理工大學科技實業(yè)總廠)擠壓成粒徑1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，冷卻后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1項目Items對照組Controlgroup0.48%Arg組0.48%Arggroup0.025%NCG組0.025%NCGgroup粗灰分Ash8.78.58.4水分Moisture7.97.97.4精氨酸Arg2.462.792.42

1.2 試驗設計及養(yǎng)殖管理

試驗用黃顙魚購自廣州市錦龍漁業(yè)有限公司，試驗養(yǎng)殖系統(tǒng)采取室內循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。黃顙魚在室外水泥池中暫養(yǎng)2周，攝食40%蛋白質和7%脂肪的試驗飼料，每天投喂2次。試驗開始時，隨機選取黃顙魚幼魚[(0.98±0.03)g] 480尾，按照試驗設計分為對照組、0.48% Arg組和0.025% NCG組，每個組設置4個桶，每桶放魚為40尾。按照黃顙魚初始體重的4%～6%投喂試驗飼料，每天投喂2次(08:30和18:30)，觀察黃顙魚攝食情況，養(yǎng)殖期間不斷調整投喂飼料量，養(yǎng)殖試驗周期設置為56 d。黃顙魚養(yǎng)殖試驗桶采取玻璃纖維桶，桶的半徑為80 cm，桶的高度為70 cm。試驗期間根據(jù)養(yǎng)殖周期平均每周換水1次，并測定水體理化指標，養(yǎng)殖期間溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量<0.20 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L，水溫27～32 ℃，pH 7.4～7.9，試驗采取自然光照。

1.3 樣品收集

飼養(yǎng)試驗結束后，黃顙魚停止攝食24 h。每個養(yǎng)殖桶隨機取8尾黃顙魚，采用MS-222溶液(120 mg/L)麻醉處理，通過尾靜脈采集血液，在4 000 r/min離心10 min，收集血液上清液部分作為血清樣品，樣品保存在-80 ℃的冰箱中。另外選取5尾黃顙魚進行解剖，采集肝臟、腸道樣品，并測定體長、體重和肝臟重。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能測定

式中：W0表示魚體初始體質量(g)；Wt表示魚體終末體質量(g)；N0表示初始魚尾數(shù)；Nt表示終末魚尾數(shù)；Wf表示飼料攝入量(g)；Lt表示試驗魚終末體長(cm)；t表示試驗天數(shù)(d)；Wg表示肝臟重(g)；Wq表示全魚重(g)。

1.4.2 飼料成分測定

飼料原料樣品分析參照AOAC(1984)[21]的方法。105 ℃烘干法測定飼料水分含量，凱氏定氮法測定飼料粗蛋白質含量，索氏抽提法測定飼料粗脂肪含量，馬弗爐灰化法測定飼料粗灰分含量。

1.4.3 血清、腸道生化指標測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清和腸道生化指標，測定指標包括：一氧化氮(NO)、補體3(C3)、補體4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)、丙二醛(MDA)含量，總抗氧化能力(T-AOC)，溶菌酶(LZM)含量，Na+K+-ATP酶(Na+K+-ATPase)、過氧化氫酶(CAT)、蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)、超氧化物歧化酶(SOD)、精氨酸酶(ARG)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、二胺氧化酶(DAO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性。

1.5 氨氮應激試驗

56 d養(yǎng)殖試驗結束后，從對照組、0.48% Arg組、0.025% NCG組的每個重復(n=4)中隨機選取20尾健康黃顙魚，采用氯化銨進行應激試驗，總氨氮濃度達到100 mg/L。觀察并記錄黃顙魚0、24、48、72 h內各組死亡情況，計算72 h內的累積死亡率(cumulative mortality rate，CMR)。

累積死亡率(%)=(應激后試驗魚死亡尾數(shù)/應激前試驗魚尾數(shù))×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SD；n=4)表示，采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。先對試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性條件則進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著再用Tukey’s檢驗方法進行多重比較；方差齊性條件不滿足，則用Dunnett’s T3檢驗法進行多重比較。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 生長性能

由表2可知，與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚增重率(P<0.05)。對照組和0.48% Arg組黃顙魚的增重率沒有顯著差異(P>0.05)。各試驗組黃顙魚的飼料系數(shù)、存活率、肥滿度和肝體比沒有顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary Arg or NCG on growth performance of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.2 腸道消化酶活性

由表3可知，飼料中添加Arg或NCG顯著影響黃顙魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性。與對照組和0.025% NCG組比，飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶活性(P<0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道脂肪酶活性(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道淀粉酶活性無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道消化酶活性的影響Table 3 Effects of dietary Arg or NCG on digestive enzyme activities of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.3 腸道功能指標

由表4可知，飼料中添加Arg或NCG顯著影響黃顙魚腸道精氨酸酶、總一氧化氮合酶、誘導型一氧化氮合酶、二胺氧化酶和Na+/K+ATP酶活性(P<0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道誘導型一氧化氮合酶活性(P<0.05)。0.025% NCG組黃顙魚腸道精氨酸酶、總一氧化氮合酶和二胺氧化酶活性顯著高于0.48% Arg組(P<0.05)。0.48% Arg組黃顙魚腸道Na+/K+ATP酶活性顯著高于0.025% NCG組(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道鳥氨酸脫羧酶活性沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道功能指標的影響Table 4 Effects of dietary Arg or NCG on intestinal function indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) U/mg prot

2.4 血清免疫指標

由表5可知，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著增強了黃顙魚血清溶菌酶含量(P<0.05)。0.025% NCG組黃顙魚血清溶菌酶含量顯著高于0.48% Arg組(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清一氧化氮、免疫球蛋白M、補體3、補體4含量無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清免疫指標的影響Table 5 Effects of dietary Arg or NCG on serum immune indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.5 血清抗氧化指標

由表6可知，與對照組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著增強了黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05)。0.48% Arg組黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性與對照組、0.025% NCG組之間沒有顯著差異(P>0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著增強了黃顙魚血清總抗氧化能力(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清一氧化氮、免疫球蛋白M、補體3、補體4含量無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清抗氧化指標的影響Table 6 Effects of dietary Arg or NCG on serum antioxidant indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.6 抗氨氮應激能力

由表7可知，應激48 h時，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著了降低了黃顙魚累計死亡率(P<0.05)。應激72 h時，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著降低了黃顙魚累計死亡率(P<0.05)；0.025% NCG組黃顙魚累計死亡率顯著低于0.48% Arg組(P<0.05)。

表7 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚累計死亡率的影響Table 7 Effects of dietary Arg or NCG on cumulative motality rate of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) %

3 討 論

Arg在調控動物生長和生理代謝中發(fā)揮著重要作用[22]。飼料Arg缺乏導致養(yǎng)殖動物生長遲緩、腸道和生殖功能障礙、免疫和神經(jīng)發(fā)育受損和高血氨癥，甚至死亡[23-24]。飼料補充0.2%和0.4% Arg能夠提高仔豬血漿Arg含量和增重[25]。飼料Arg水平為2.74%時黃顙魚的增重和飼料效率顯著增加[26]。本試驗中，補充0.48% Arg使飼料Arg含量達到2.79%，對黃顙魚的增重率和飼料系數(shù)沒有顯著影響。但是本試驗得到了另一個有趣而重要的結果，相同條件下在黃顙魚飼料中添加0.025% NCG卻能夠顯著提高黃顙魚的增重率。飼料中添加NCG顯著提高黃顙魚增重率，可能黃顙魚對NCG合成的內源Arg利用效率高于飼料添加的Arg。大鼠的飼料中添加1% Arg或0.1% NCG能夠減少肝臟和血漿的氧化應激，0.1% NCG的作用效果優(yōu)于1% Arg[27]。斷奶仔豬飼料中添加0.6% Arg或0.08% NCG顯著提高生長性能，促進腸道生長和完整性，并上調腸道熱休克蛋白70(HSP70)的表達[28]。目前關于Arg或NCG在水產(chǎn)動物中作用效果的比較研究尚未見報道，關于Arg和NCG作用機制的差異還有待于進一步深入研究。

魚類的生長與腸道消化、吸收能力休戚相關，腸道的消化酶和刷緣膜酶在營養(yǎng)物質的消化和吸收過程中發(fā)揮重要作用[29]。Arg及其代謝物通過促進組織完整性和細胞增殖對腸道產(chǎn)生有益影響[30]。本試驗中，飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶活性，0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道脂肪酶活性，但Arg或NCG對黃顙魚腸道淀粉酶活性沒有顯著影響。與本試驗結果一致，仿刺參飼料中添加Arg顯著增加腸道蛋白酶活性，但并不影響脂肪酶和淀粉酶活性[31]。建鯉飼料中補充Arg能夠和改善腸道蛋白酶和脂肪酶活性，但并不影響淀粉酶活性[32]。雜交鱘飼料補充Arg增加腸道蛋白酶和淀粉酶活性[33]。Arg對不同魚類消化酶的影響不盡相同，但關于NCG影響魚類消化酶方面的研究較少。研究顯示，羅非魚飼料補充NCG促進了肌肉中的脂肪沉積[15]。Huang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，NCG能夠調控海鱸脂類代謝，通過促進脂類分解緩解脂肪肝癥狀。因此，飼料中添加Arg和NCG對黃顙魚腸道消化酶的作用方式不同，Arg可能主要作用于腸道蛋白酶，促進蛋白質的消化吸收；NCG則通過提高腸道脂肪酶活性促進黃顙魚對脂類的消化吸引和代謝，從而提高黃顙魚生長性能。

Arg的代謝主要有2個途徑，分別是精氨酸酶途徑和一氧化氮合成酶途徑。精氨酸酶途徑是主要的代謝途徑，Arg在精氨酸酶的催化下生成鳥氨酸和尿素，鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶的作用下生成多胺類物質。多胺在小腸黏膜的生長、發(fā)育、成熟以及適應性和損傷后的修復中具有重要作用[35]。本試驗在飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道精氨酸酶活性，表明NCG能夠增強Arg在黃顙魚體內的代謝，促進黃顙魚腸道黏膜生長和發(fā)育，NCG的作用效果優(yōu)于飼料中直接添加Arg。Arg另一條代謝途徑是通過一氧化氮合酶產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮具有維持腸道功能的作用，如調節(jié)腸道免疫功能、促進腸道細胞的轉移、改善腸道發(fā)育等[35]。本試驗發(fā)現(xiàn)飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道總一氧化氮合酶和誘導型一氧化氮合酶活性。飼料中補充NCG顯著增加了湖羊和大菱鲆NOS活性[16,36]。二胺氧化酶是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞膜內酶，其活性反映了黏膜細胞蛋白與核酸的合成和代謝[37]。本試驗中飼料添加0.025% NCG顯著提高黃顙魚腸道二胺氧化酶活性，說明NCG在促進腸道黏膜生長方面有較好的作用效果。Na+K+-ATP酶具有產(chǎn)生維持膜電位、調控細胞內外離子成分和消化產(chǎn)物的跨上皮吸收等功能，在腸道營養(yǎng)物質轉運方面具有重要的作用[38]。本試驗條件下，飼料中添加NCG對黃顙魚腸道Na+K+-ATP酶活性沒有顯著影響，但添加0.48% Arg顯著提高了Na+/K+ATP酶活性。綜上可知，飼料中添加NCG可以促進腸道黏膜生長發(fā)育和改善腸道功能，添加Arg可能有助于增強營養(yǎng)物質的轉運和吸收。

溶菌酶是非常重要的抗菌物質，可以溶解細菌的細胞壁，激活補體旁路和吞噬細胞活性，參與非特異性免疫防御[39]。本試驗中，飼料補充0.48% Arg或0.025% NCG顯著提升黃顙魚血清溶菌酶含量，NCG的作用效果優(yōu)于Arg。魚類細胞的氧化應激是由于超氧陰離子、羥自由基等活性氧過量產(chǎn)生引起，提高谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和氧化物酶等的活性和產(chǎn)生還原型谷胱甘肽等抗氧化物質有助于減少活性氧的產(chǎn)量[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)，Arg和NCG均可通過促進抗氧化酶活性及一氧化氮通路的激活來保護羔羊免受宮內生長受限誘導的肝臟氧化損傷[42]。本試驗中，飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力，NCG可能通過促進體內Arg合成，進而增強了黃顙魚抗氧化能力。但是，飼料中添加0.48% Arg對黃顙魚抗氧化能力卻沒有顯著影響。本試驗條件下，氨氮應激72 h時，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著降低了黃顙魚累計死亡率，0.025% NCG組黃顙魚累計死亡率顯著低于0.48% Arg組。NCG提高黃顙魚抗氨氮應激能力的作用效果優(yōu)于Arg，這與其在提高黃顙魚免疫和抗氧化能力方面的研究結果一致。

4 結 論

綜上所述，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚體增重，腸道脂肪酶、總一氧化氮合酶、誘導型一氧化氮合酶、精氨酸酶、二胺氧化酶活性及血清谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力，而飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶、Na+/K+ATP酶活性。飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著增強了黃顙魚血清溶菌酶含量，降低氨氮應激48和72 h累計死亡率。本試驗條件下，結合生長性能、腸道健康、免疫、抗氧化功能指標綜合評價，飼料中添加NCG的作用效果優(yōu)于直接補充Arg。