干旱脅迫下不同中間砧對蘋果苗生理特性及MdPIP1-1基因表達的影響

石曉英，王 榮，姬新梅，王健強，徐繼忠，張學英，周莎莎

(河北農業(yè)大學園藝學院，河北 保定 071001)

干旱是限制果樹生長的主要非生物因素，對果樹的產(chǎn)量及品質有重要影響。我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量均處于世界首位，大多優(yōu)質蘋果產(chǎn)區(qū)分布在降水偏少、水資源匱乏的淺山丘陵地區(qū)，加之水資源在時間和空間上的分布極不平衡，果園旱災頻發(fā)[1]。近年來，矮砧密植栽培已成為蘋果生產(chǎn)的主流栽培模式[2]。我國應用的蘋果矮化砧木主要有SH系、M系、G系等，主要利用方式為矮化中間砧[3]。因此研究矮化砧木特別是矮化中間砧對嫁接品種抗旱性的影響對于提高果樹生產(chǎn)水平具有重要意義。

關于蘋果矮化砧木的抗旱性研究報道較多[4-9]。干旱脅迫抑制了蘋果砧木的光合作用，導致葉片的葉綠體超微結構受到破壞[5]。隨著干旱脅迫時間的延長，植株旱害指數(shù)升高，葉片相對含水量降低，超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性先上升后下降，根系生長情況發(fā)生改變，根系活力降低[6]。植物對非生物脅迫的響應不僅表現(xiàn)在外部形態(tài)特征、生理生化變化等方面，其對逆境的耐受性也受多種基因表達調控和信號轉導介導[10]。研究發(fā)現(xiàn)，質膜水通道蛋白基因PIPs可參與植株體內的水分跨膜運動，植物組織內PIPs的表達在干旱脅迫條件下發(fā)生改變[11]。目前多數(shù)研究是對矮化砧木的抗旱性進行探究[7-9]，而關于不同中間砧對嫁接品種抗旱性影響的研究較少。本試驗以‘平邑甜茶’為基砧，河北省中南部廣泛應用的SH40、北部常用的GM256、河北農業(yè)大學選育的矮化砧木優(yōu)系黃6為中間砧，嫁接‘天紅2號’紅富士蘋果苗為試材，進行干旱處理，研究不同中間砧對蘋果苗生理特性和MdPIP1-1基因表達的影響，以期為蘋果抗旱砧木的選擇與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗在河北農業(yè)大學創(chuàng)新試驗園抗旱棚進行。試驗材料為盆栽蘋果苗，基砧為‘平邑甜茶’，矮化中間砧分別是GM256、SH40、黃6，于2019年4月1日嫁接‘天紅2號’紅富士。2019年6月27日選擇生長一致的試材，統(tǒng)一澆透水。試驗共設2個處理，干旱脅迫處理(T)：澆透水后至7月6日不再澆水；對照(CK)：維持土壤相對含水量在70%～85%。采用隨機區(qū)組設計，3次重復。每天調查植株生長情況，出現(xiàn)1級旱害開始取樣，每隔1 d取樣1次，7月6日大部分植株達到4級旱害，取樣后復水，復水3 d后最后1次取樣。取中部功能葉片用于生理指標測定，上部幼嫩葉片用于基因表達量測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤含水量測定 采用環(huán)刀法進行取土，取土深度為10 cm，烘干法測定土壤含水量。

土壤絕對含水量(%)=[(原土重 - 烘干土重)/烘干土重]×100%

土壤相對含水量(%)=(土壤絕對含水量/田間最大持水量)×100%

1.2.2 旱害指數(shù)測定 試驗期間每天調查植株旱害情況。按照以下標準進行旱害分級：1級—葉片輕度萎蔫；2級—葉片中度萎蔫，且基部有3～5片葉發(fā)黃；3級—葉片重度萎蔫，且有1/4～1/3葉片焦枯；4級—葉片重度萎蔫，且有1/2及以上葉片焦枯[11]。

旱害指數(shù)(DI)=[∑(代表級值×本級株數(shù))/(最高級數(shù)值×處理總株數(shù))]×100%

1.2.4 實時熒光定量PCR分析MdPIP1-1基因表達量 蘋果葉片總RNA利用天根DP441RNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取，用NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測定儀檢測RNA濃度和OD值。利用反轉錄試劑盒(全式金生物技術有限公司,北京，中國)合成cDNA，使用熒光實時定量PCR儀檢測表達量，試驗設置3個重復。水通道蛋白基因MdPIP1-1引物序列如表1所示。

表1 MdPIP1-1基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下土壤相對含水量變化

由表2可知，3種矮化中間砧蘋果苗的土壤相對含水量均隨著干旱脅迫時間的延長而降低。干旱脅迫第3 d時，3種中間砧苗的土壤相對含水量均降至70%以下，達到輕度干旱水平。干旱脅迫第5 d時，土壤相對含水量低于40%，達到重度干旱水平。干旱脅迫第7 d、9 d，土壤相對含水量均降至30%以下；不同中間砧苗的土壤相對含水量沒有顯著差異。

表2 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗的土壤相對含水量變化

2.2 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗旱害指數(shù)比較

由表3可以看出，隨著干旱處理天數(shù)的增加，不同矮化中間砧蘋果苗的旱害指數(shù)均呈上升趨勢且存在顯著差異。干旱脅迫處理第5 d時，只有GM256中間砧蘋果苗出現(xiàn)旱害，旱害指數(shù)為13.67%。干旱脅迫處理第6～9 d時，3種中間砧蘋果苗均出現(xiàn)了一定程度的旱害，其中黃6中間砧苗的旱害指數(shù)最低。干旱脅迫處理第9 d時，黃6的旱害指數(shù)為29.67%，而GM256中間砧苗的旱害指數(shù)高達91.67%。從旱害指數(shù)來看，黃6中間砧苗的抗旱性較強，SH40次之，GM256最弱。

表3 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗的旱害指數(shù)

2.3 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗葉片的葉綠素熒光參數(shù)

由圖1可知，在干旱處理第3 d時，GM256中間砧蘋果苗的Fv/Fm值顯著降低，SH40、黃6中間砧苗與其對照差異不顯著。干旱脅迫處理第9 d時，GM256中間砧苗的Fv/Fm值與對照相比顯著下降11.47%；黃6的Fv/Fm值下降幅度最小。復水3 d后，干旱處理的3種中間砧苗的Fv/Fm值均呈現(xiàn)上升趨勢，與正常供水對照無顯著差異。

2.4 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率

如表4所示，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的超氧陰離子產(chǎn)生速率無顯著差異。干旱脅迫下3～9 d期間，3種中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率均隨著干旱脅迫時間的延長而增加。干旱脅迫第3 d時，GM256中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著高于其他中間砧苗及其對照。干旱脅迫第9 d時，GM256的增加幅度最大，與對照相比增加了1.59倍；而黃6與其對照無顯著差異。復水3 d后，GM256中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率分別是SH40和黃6的1.45、1.46倍。干旱脅迫期間和復水后3 d，GM256中間砧苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率均基本顯著高于其他處理。

表4 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率

2.5 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗葉片的POD、SOD活性

由圖2可以看出，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的POD活性差異不顯著。干旱脅迫第3 d時，3種矮化中間砧苗的POD活性均顯著高于對照。干旱脅迫第3～5 d時，黃6與SH40中間砧苗的POD活性呈上升趨勢，而GM256呈下降趨勢。干旱脅迫第5～9 d時，SH40、GM256中間砧苗的POD活性呈持續(xù)下降趨勢，在干旱脅迫第9 d時，較對照分別降低了62.27%、69.72%。黃6中間砧苗在干旱脅迫第5～7 d下降，第7 d和第9 d時與對照差異不顯著。復水后3 d，黃6與SH40中間砧苗的POD活性恢復到正常水平，而GM256的POD活性仍顯著低于對照，僅為對照的46.91%。

由圖3可以看出，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的SOD活性無明顯差異。干旱脅迫第3 d時，3種矮化中間砧苗的SOD活性均顯著高于對照。干旱脅迫第3～5 d時，黃6中間砧苗的SOD活性呈上升趨勢，在第5 d時達到峰值，干旱脅迫第5～9 d時呈下降趨勢；SH40和GM256中間砧苗的SOD活性在干旱脅迫第3～9 d時，呈持續(xù)下降趨勢，GM256降低幅度最大，與對照相比降低了85.78%。干旱脅迫第9 d時，SH40、黃6和GM256中間砧蘋果苗的SOD活性顯著低于對照，分別為對照的45.26%、63.27%和14.22%，且三者間差異顯著。復水后3 d，3種中間砧苗的SOD活性均顯著上升，黃6、SH40中間砧苗與對照相比無顯著差異，而GM256中間砧苗僅達到對照的64.88%。

2.6 干旱脅迫下不同中間砧蘋果苗的水通道蛋白基因MdPIP1-1表達量分析

由圖4可知，隨著干旱脅迫時間的延長，3種矮化中間砧苗葉片中MdPIP1-1基因的表達量均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，正常供水條件下的3種中間砧苗的基因表達量在各時期無顯著差異。其中，SH40和GM256葉片中MdPIP1-1基因的表達量在干旱脅迫第5 d時達到最高，分別為對照的2.79、3.45倍；干旱脅迫第7 d、第9 d，相對表達量與對照無顯著差異。黃6的基因表達量在干旱脅迫第7 d時達到最高，較對照升高了2.11倍；在干旱脅迫第9 d時，與對照無顯著差異。

3 討 論

優(yōu)良砧木的應用需要從各方面進行綜合評價。張靜等[20]以PEG-6000作脅迫劑模擬室外干旱，發(fā)現(xiàn)M26抗旱性優(yōu)于M9。但M26作中間砧，其幼齡蘋果樹在河北中北部易發(fā)生抽條現(xiàn)象，越冬能力差[21]。黃6是河北農業(yè)大學蘋果課題組從八棱海棠中選出的矮化砧木優(yōu)系，在本試驗中作中間砧嫁接紅富士表現(xiàn)出了較強的抗旱性，關于黃6的抗旱機理正在從基因轉錄水平進行研究，作為蘋果矮化砧木在田間的綜合表現(xiàn)尚需進一步的區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗以進行全面評價。

4 結 論

本文研究了干旱脅迫下‘天紅2號/黃6/平邑甜茶’、‘天紅2號/SH40/平邑甜茶’、 ‘天紅2號/GM256/平邑甜茶’盆栽蘋果苗的旱害指數(shù)和相關生理指標，并分析了MdPIP1-1基因在3種砧穗組合中的表達情況，得出以下結論：(1)3種中間砧蘋果苗的抗旱性由強至弱依次為‘天紅2號/黃6/平邑甜茶’>‘天紅2號/SH40/平邑甜茶’>‘天紅2號/GM256/平邑甜茶’。(2)MdPIP1-1基因響應植株干旱脅迫，其表達量峰值出現(xiàn)早晚與植株抗旱性強弱有關。