Olmsted綜合征一例基因突變分析

鄧 維，蘇 偉，劉曉雁

掌跖角化病是一組遺傳異質性的皮膚病，而Olmsted綜合征（Olmsted syndrome，OS）是其中一種罕見的類型。OS的臨床特征表現(xiàn)為殘毀型掌跖角化和腔口周圍角化性皮損。1927年Olmsted首次報道在1例意大利裔美國年輕男性患有嚴重的掌跖角化、假指骨、彎曲增厚的指甲和口唇角化過度及口角裂隙。至今超過50例OS臨床患者已被報道[1-10]。近年來國內外對于OS致病基因的探索取得了重大進展。2012年林志淼等[1]率先報道了在6個OS綜合征家族中發(fā)現(xiàn)了3個TRPV3錯義突變位點：p.Gly573Ser、p.Gly573Cys和p.Trp692Gly。所有患者在1歲之前均有不同程度的掌跖角化過度，角膜過度角化，脫發(fā)和嚴重的病變疼痛和瘙癢。TRPV3基因又稱瞬時受體離子通道3基因（transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3）， 其 在 角 質 形 成 細胞中高度表達，可編碼電壓和熱敏離子通道。將TRPV3突變體的cDNA轉染到HEK293細胞，證實這些突變都是功能獲得性突變[1]。在此之后，間斷有TRPV3基因的新突變被報道并證實與OS發(fā)病相關，包括 p.Gly573Ser、p.Gly573Ala、p.Trp692Cys、p.Leu673Phe、p.Gly568Asp、p.Gly568Cys, p.Gly262del、p.Gln580Pro 和 PGly568Val[2-10]。

筆者收集了1例臨床表現(xiàn)考慮為OS的5個月齡患兒，為明確診斷及遺傳咨詢，行患兒全外顯子基因測序，并對其父母外周血DNA行一代測序驗證，發(fā)現(xiàn)了TRPV3基因c.1703G>T p.Gly568Val錯義突變，并排除父母攜帶該突變，確定為散發(fā)病例。目前p.Gly568Val致OS發(fā)病國內尚無報道，現(xiàn)將相關結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患兒，男，5個月齡。因雙手指尖、足跖、臀部、外耳道及口周角化性黃紅色斑塊伴皸裂、脫屑4個月，于2018年10月18日就診。患兒出生后1個月，雙手指尖、雙足跖部出現(xiàn)數(shù)個粟粒至蠶豆大小黃色角化性丘疹，部分融合成硬幣大小斑塊，雙側外耳道彌漫紅斑，伴脫屑，唇部干裂，口角裂隙，雙手指尖和雙足跖斑塊逐漸增厚并脫落，但仍陸續(xù)有新發(fā)皮損?；純合档?胎第1產(chǎn)，出生后奶粉喂養(yǎng)，無特殊食物、藥物過敏史，父母非近親結婚，家族否認類似疾病史，否認遺傳病史。體格檢查：生長發(fā)育正常，視力、聽力、智力檢測無異常，系統(tǒng)檢查無明顯異常?？谥芸梢婞S色角化性斑塊，雙側外耳道可見黃色黏稠性痂。雙手指尖紅腫，可見角化過度伴片狀脫屑，肛周、雙側足跖可見黃色角化性斑塊。十指（趾）甲板變薄、彎曲、部分斷裂（圖1）。頭發(fā)、眉毛稀疏，易折斷。口腔黏膜未見異常。實驗室及輔助檢查：外周血白細胞計數(shù) 12.88×109/L[正常值（4.00～ 10.00）×109/L]，中性粒細胞絕對值 6×109/L[（2～7）×109/L）]；肝腎功能、尿常規(guī)正常；雙手足關節(jié)X線檢查未見明顯異常。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)，初步診斷：Olmsted綜合征待排。

圖1 Olmosted綜合征患兒臨床表現(xiàn)

1.2 目標基因捕獲及高通量測序

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者及家屬簽署知情同意書，抽取患兒及其父母外周血各約2 ml（EDTA抗凝），用QIAamp全血DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）按說明書提取基因組DNA。委托北京邁基諾公司應用GenCap液相捕獲目標基因技術，捕獲目前已經(jīng)定位全部基因的編碼外顯子區(qū)域。利用Illumina Nextseq 500第二代測序儀測序。用GATK軟件對單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失突變（InDels）等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，篩選得到SNPs及InDels頻率＜0.05，且經(jīng)多個數(shù)據(jù)庫預測結果均為致病性的位點作為與疾病相關的候選位點。

1.3 Sanger測序驗證

根據(jù)需要測序的DNA片段合成引物，用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法進行擴增，用ABI3730xl測序儀（美國Applied Biosystems公司）以Sanger測序法進行測序，測序結果使用Mutation Surveyor軟件與參考序列進行比對分析。患者目標區(qū)域平均測序深度為153.55，99.92%目標區(qū)域覆蓋度，其中＞4×目標區(qū)域覆蓋度為99.68%，＞10×目標區(qū)域覆蓋度為99.27%，＞20×目標區(qū)域覆蓋度為98.31%。

2 結果

TRPV3基因突變分析：13號外顯子c.1703G>T雜合突變（編碼區(qū)第1703號核苷酸由鳥嘌呤變異為胸腺嘧啶），導致氨基酸改變 p.G568V（第568號氨基酸由甘氨酸變異為纈氨酸），為錯義突變。c.1703G>T位點未在千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及邁基諾內部1 000名正常人群數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，SIFT、PolyPhen_2、REVEL分別預測為有害（disease causing）、有害、有害，GERP++預測位點位于保守區(qū)域，且該功能域報道該區(qū)域編碼瞬時受體離子通道II；該結構域存在于瞬時受體離子通道（Trp）蛋白家族中。該位點已有HGMD商業(yè)版數(shù)據(jù)庫報道與OS相關[9]，經(jīng)家系驗證患兒父母該位點無變異，患兒屬于自發(fā)突變（圖2）。TRPV3基因為常染色體顯性遺傳方式，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)患兒TRPV3基因不遺傳自父親與母親，符合其家族史。最后診斷：Olmsted 綜合征。

圖2 Olmsted綜合征患兒及其父母TRPV3基因突變Sanger測序圖

3 討論

OS的報道目前多數(shù)為散發(fā)病例，好發(fā)于男性（男女比例5:1）[3,4]。OS主要表現(xiàn)為手、足、口腔周圍嚴重角質化，頭發(fā)稀疏以及嚴重的病變疼痛和瘙癢。其發(fā)病機制尚不清楚，目前人們認為突變后的TRPV3通道持續(xù)開放，導致胞內Ca2+濃度升高，進而誘導皮膚角質形成細胞凋亡從而促進了OS的發(fā)生[1]。TRPV3基因在皮膚角化、毛發(fā)生長以及瘙癢機制中發(fā)揮重要的作用。OS遺傳方式近年來已被明確為常染色體顯性遺傳，但常染色體顯性遺傳患者的異常性狀表達程度可有不同，且致病基因也可有一定自然突變率。本病診斷主要依靠特征性的臨床表現(xiàn)和基因檢測，組織病理改變缺乏特異性。臨床上本病需要與發(fā)生于嬰兒期的遺傳性角化過度性疾病相鑒別，主要包括進行性遺傳性手足角化病（Meleda?。┖蚔ohwinkel殘毀性遺傳性角皮?。ㄕ契臯lI型外胚葉發(fā)育不良）。三種疾病均有肢端伸側受累、紅斑邊界清楚的特點，但Meleda病和Vohwinkel綜合征常伴有多汗癥，無腔口周圍角化過度；而OS有腔口周圍角化過度，但不伴出汗增多。分子遺傳學上，Vohwinkel綜合征為常染色體顯性遺傳，致病基因位于Iq21，由編碼兜甲蛋白的loricrin基因突變所致。Meleda病屬于常染色體隱性遺傳，致病基因為SLURP-1。Vohwinkel綜合征還容易合并全身性疾病，如肌病、感覺神經(jīng)性耳聾等。這些疾病臨床表現(xiàn)有時相似，則需進行基因檢測協(xié)助明確診斷。

2015年，TRPV3基因c.1703G>T, p.Gly568Val錯義突變被首次報道在1例7歲巴西OS女性患兒的基因檢測重發(fā)現(xiàn)，但并未證實其是否為獲得功能的突變[9]。隨后2017年Nagai等報道新發(fā)現(xiàn)1例日本OS患者也出現(xiàn)Gly568Val錯義突變，且其通過計算機模擬數(shù)據(jù)分析實驗確定其為致病性突變[10]。本例患兒為目前發(fā)現(xiàn)的該基因突變位點所致的第3例OS患兒，也進一步證實了c.1703G>T, p.Gly568Val錯義突變與OS致病的相關性。通過檢索目前已有的20余篇TRPV3基因突變與OS的相關報道發(fā)現(xiàn)，不同的OS患者即使TRPV3基因突變位點相同，其發(fā)病年齡、皮損分布范圍、皮損嚴重程度等臨床表型也不盡相同，可能環(huán)境因素和（或）修飾基因在其中也發(fā)揮作用：目前已報道的具有p.Gly568Val錯義突變的2例患兒相比，前者為18月齡發(fā)病的巴西患兒，起病較早，僅有局灶性和輕中度掌跖角化，無嘴唇干燥、口角皸裂及耳受累；后者為11歲發(fā)病的日本患兒，起病較晚，卻患有彌漫性和嚴重的掌跖角化病，未提及口周、耳道受累。而本報道的患兒在出生后1個月即發(fā)病，為目前報道的最早發(fā)病的患兒；其全身皮損廣泛且嚴重，并伴有明顯瘙癢癥狀。造成這些個體差異的原因目前仍不明確，因此TRPV3基因型與表現(xiàn)型之間的關系需要進一步研究。

本例患兒的治療目前應用維A酸乳膏剝脫角質、糠酸莫米松乳膏抗炎，夫西地酸乳膏預防感染，潤膚劑保濕等外用對癥治療，但皮損無明顯緩解，瘙癢癥狀無改善，未來皮損進展或緩解趨勢無法預期。近年來隨著對OS發(fā)病機制的了解加深，選擇性靶向TRPV3基因治療為角化性皮膚病的治療提供了全新的思路。Glenmark制藥公司在臨床炎癥與神經(jīng)疼痛模型中研發(fā)出一種TRPV3拮抗劑GRC15300，GRC15300已通過1期臨床試驗，順利進入后續(xù)試驗研究階段。隨著TRPV3通道特異性激動劑與拮抗劑的相繼研發(fā)，可能為TRPV3通道相關的遺傳性角化過度性皮膚病的治療提供一種很好的解決方案。