魔芋莖腐病發(fā)病程度對(duì)其根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

趙興麗， 張 莉， 羅林麗， 周羅娜， 賀圣凌， 張 欣， 周玉鋒

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】魔芋經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，其塊莖含有豐富的葡甘聚糖，具有良好的營養(yǎng)和保健特性[1-3];可以食用或釀酒，具有降血脂、血清膽脂及消腫攻毒之功效[4]，還具有抗糖尿病的作用[5-8]，對(duì)人體皮膚也具有益處[9]，同時(shí)還是重要的添加劑和化工原料[10]。魔芋具有較好的市場(chǎng)需求，現(xiàn)實(shí)卻供不應(yīng)求，原因是魔芋土傳病害(軟腐病、根/莖腐病、白娟病等)是制約其擴(kuò)大種植規(guī)模的重要原因之一。魔芋莖腐病是由鐮刀菌(Fusariumspp.)侵染引起的一種真菌性病害，主要危害地下塊莖，發(fā)病初期為褐色水浸漬病斑，根部、塊莖腐爛變黑，植株生長矮小，葉片發(fā)黃，后期葉柄枯萎，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)植株死亡[11]。鐮刀菌(Fusariumspp.)是土壤習(xí)居菌，既可以在病殘?bào)w上生存，也可單獨(dú)在土壤中以休眠態(tài)存活多年[12]，待溫濕度條件滿足時(shí)，病菌便侵染魔芋根系和塊莖致使植株發(fā)病。病原菌在長期進(jìn)化和生存競爭中，可與根際土壤中有益微生物形成互生、共生、寄生、競爭、拮抗及吞食等關(guān)系[13]；其中有益微生物通過養(yǎng)分競爭、拮抗作用、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性和重寄生作用等機(jī)制抑制土壤中的病菌、促進(jìn)植物生長[14]；而病原菌的大量積累將導(dǎo)致植株死亡[15]。了解魔芋莖腐病不同發(fā)病程度下根際土壤微生物(尤其是有益微生物)的變化，不僅可為魔芋-土壤-微生物的互作關(guān)系提供理論依據(jù)，且對(duì)指導(dǎo)魔芋土傳病害防治具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】影響魔芋根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的因素較多，如海拔、種植年限及種植模式等[16-18]。研究表明，隨著海拔高度的增加，魔芋根際土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌和微生物總量均相應(yīng)增加[19]；長期連作魔芋根際土壤細(xì)菌數(shù)量增多、真菌和放線菌數(shù)量卻減少[20]；魔芋與不同作物或林木套種后發(fā)現(xiàn)，林下魔芋土壤微環(huán)境優(yōu)于大田。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，施用有益微生物也會(huì)引起魔芋根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[21-22]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著土壤微生物群落研究的發(fā)展，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法因費(fèi)力、昂貴、耗時(shí)，并且分辨率較低等特點(diǎn)[23]，逐漸被高通量測(cè)序技術(shù)(Illumina Mi Seq)等新測(cè)序技術(shù)所代替。雖然，前人已采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)魔芋不同海拔、連作、套種以及施用有益微生物等條件下根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，但有關(guān)魔芋莖腐病發(fā)病程度下根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以魔芋莖腐病為對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定輕度發(fā)病、中度發(fā)病、重度發(fā)病情況下根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性；比較不同發(fā)病程度下魔芋根際土壤中有益微生物的變化，探析魔芋莖腐病發(fā)病程度對(duì)其根際有益微生物的影響，以期為利用土壤微生物多樣性和有益微生物防控魔芋莖腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 土樣采自貴州省獨(dú)山縣苗泥村(東經(jīng)107.61°、緯度25.86°)魔芋種植地，品種為花魔芋。參照軟腐病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[24]將魔芋莖腐病發(fā)病程度分為輕度、中度和重度3個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)各選擇3株植株，去掉其根際表層土壤后，取魔芋塊莖周圍的土壤，混勻，無菌自封袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 試劑 引物[真菌ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)、細(xì)菌338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、古細(xì)菌524F10extF(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958RmodR(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)]以及試劑(10×Buffer、2.5 mM dNTPs、rTaq Polymerase、BSA、Template DNA)，均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設(shè)備 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，TAS-990F原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，Optima 8000電子耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Perkin Elmer)。

1.2 方法

1.2.1 魔芋根際土壤含水量、pH及養(yǎng)分含量測(cè)定 稱取一定量的土樣置于60℃的烘箱中烘干，通過土壤鮮重和干重統(tǒng)計(jì)土壤的含水量；取5 g土壤加入到裝有45 mL無菌水的錐形瓶中，150 r/min震蕩30 min，使土壤完全溶解于水中，pH計(jì)檢測(cè)土壤懸液的pH。采用酸式滴定管測(cè)定土壤全氮，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定土壤中磷的含量，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定土壤中鉀和有效磷的含量，采用電子耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定土壤中速效鉀的含量。3次重復(fù)，取平均值。

1.2.2 魔芋根際土壤高通量測(cè)序 分析天平稱取0.5 g魔芋根際土壤樣品，提取土壤總DNA，使用引物ITS1F和ITS2R、338F和806R以及524F10extF和Arch958RmodR分別擴(kuò)增真菌ITS1F-ITS2R區(qū)域、細(xì)菌338F-806R區(qū)域以及古細(xì)菌524F10extF-Arch958RmodR區(qū)域的基因片段。PCR體系(20 μL)：10×Buffer，2 μL；2.5 mM dNTPs，2 μL；上游引物0.8 μL；下游引物 0.8 μL；rTaq Polymerase 0.2 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng，補(bǔ)水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：真菌和古細(xì)菌(95℃預(yù)變形3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，10℃保存)；細(xì)菌(95℃預(yù)變形3 min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)27次，72℃延伸10 min，10℃保存)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用Quanti FluorTM-ST(Promega，USA)系統(tǒng)定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物濃度，依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina Miseq 300平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。最終數(shù)據(jù)利用云平臺(tái)(https：//www.i-sanger.com)進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在Domain(域)，kingdom(界)，Phylum(門)，Class(綱)，Order(目)，F(xiàn)amily(科)，Genus(屬)，Species(種)等水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。組間顯著性差異檢驗(yàn)根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H test)方法，對(duì)不同組微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平，獲得組間顯著性差異物種。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用WPS 2007及DPS 7.05對(duì)土壤養(yǎng)分及根際微生物屬水平上各類真菌、細(xì)菌以及古細(xì)菌的相對(duì)豐度以及多樣性進(jìn)行分析。細(xì)菌和古菌16S rRNA采用Silva數(shù)據(jù)庫(Release132 http：//www.arb-silva.de)進(jìn)行比對(duì)；真菌ITS采用Unite數(shù)據(jù)庫(Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋根際土壤的含水量、pH及養(yǎng)分含量

從表1看出，魔芋不同發(fā)病程度其土壤含水量為79.28～84.61%，表現(xiàn)為中度>重度>輕度，其中，中度發(fā)病土壤的含水量顯著高于輕度發(fā)病土壤，其余發(fā)病程度土壤間無顯著差異。魔芋不同發(fā)病程度其土壤pH為5.11～5.22，表現(xiàn)為輕度>中度>重度，各發(fā)病程度土壤間差異顯著。魔芋不同發(fā)病程度土壤中氮的含量存在明顯差異，表現(xiàn)為中度>重度>輕度，中度發(fā)病土壤的氮含量顯著高于輕度發(fā)病土壤，其余發(fā)病程度土壤間無顯著差異；魔芋不同發(fā)病程度其土壤中磷、鉀、有效磷以及速效鉀的含量均無顯著性差異，其中鉀和有效磷的含量均表現(xiàn)為輕度>中度>重度，速效鉀的含量表現(xiàn)為重度>輕度>中度。

表 1 魔芋根際土壤的含水量、pH及養(yǎng)分含量

2.2 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤微生物的多樣性

2.2.1 魔芋根際土壤總DNA的PCR擴(kuò)增效果 從圖1看出，序號(hào)1～9的基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增均在250～500 bp獲得相應(yīng)的條帶，序號(hào)10～18的基因片段均在500～750 bp獲得相應(yīng)的條帶，序號(hào)19～27的基因片段均在500 bp左右獲得相應(yīng)的條帶，其中，除序號(hào)1～9的條帶有點(diǎn)拖尾和CK無條帶外，其余條帶都很明亮，說明提取獲得的DNA量能滿足后續(xù)測(cè)序所需。

注：1～9，擴(kuò)增ITS基因序列所得產(chǎn)物的凝膠電泳條帶；10～18，擴(kuò)增16S rRNA片段獲得產(chǎn)物的凝膠電泳條帶；19～27，擴(kuò)增524F10extF-Arch958RmodR片段獲得產(chǎn)物的凝膠電泳條帶；1～3、10～12及19～21，輕度發(fā)??；4～6、13～15及22～24，中度發(fā)病；7～9、16～18及25～27，重度發(fā)病。

2.2.2 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu) 從圖2看出，在屬的分類水平下，不同發(fā)病程度魔芋根際土壤中富含多個(gè)屬類微生物，其中優(yōu)勢(shì)真菌包括被孢霉屬(Mortierellaspp.)、綠核菌屬(Ustilaginoideaspp.)、毛殼菌屬(Chaetomiaceaespp.)和假單胞菌屬(Pseudeurotiuspp.)等；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括酸桿菌屬(Acidobacterspp.)、黃色桿菌屬(Xanthobacteraceaespp.)、念珠菌屬(Candidatusspp.)、病毒桿菌(Vicinamibacteralesspp.)和緩生根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)等；優(yōu)勢(shì)古細(xì)菌包括水生古細(xì)菌(Bathyarchaeotaspp.)、亞硝基球菌屬(Nitrococcusspp.)、甲烷胞菌屬(Methanocellaspp.)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcinaspp.)等。各微生物在魔芋根際土壤中的含量存在一定的差異性。

注：A，不同發(fā)病程度下魔芋根際土壤真菌群落組成；B，不同發(fā)病程度下魔芋根際土壤細(xì)菌群落組成；C，不同發(fā)病程度下魔芋根際土壤古細(xì)菌群落組成。

2.2.3 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤的微生物多樣性 從表2看出，魔芋根際土壤中真菌、細(xì)菌以及古細(xì)菌的覆蓋率均大于97.00%，其中，古細(xì)菌類群覆蓋率均為100%，真菌覆蓋率均大于99%，細(xì)菌類群覆蓋率為97.00%～98.00%，基本涵蓋了各處理魔芋根際土壤中所有真菌、細(xì)菌、古細(xì)菌類群。豐富度指數(shù)中Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)及Chao 1指數(shù)均呈細(xì)菌>真菌>古細(xì)菌，真菌的3個(gè)指數(shù)均呈重度>輕度>中度，細(xì)菌和古細(xì)菌的3個(gè)指數(shù)均呈輕度>中度>重度；發(fā)病程度越高，根際土壤中細(xì)菌和古細(xì)菌的豐富度越低。多樣性指數(shù)中香農(nóng)指數(shù)呈細(xì)菌>真菌>古細(xì)菌，真菌的香農(nóng)指數(shù)均呈重度>中度>輕度，細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)呈中度>輕度>重度，古細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)呈中度=重度>輕度；辛普森指數(shù)呈古細(xì)菌>細(xì)菌>真菌，真菌的辛普森指數(shù)均呈輕度>重度=中度，細(xì)菌的辛普森指數(shù)呈重度>輕度>中度，古細(xì)菌的辛普森指數(shù)呈重度>中度=輕度。發(fā)病程度對(duì)魔芋根際土壤的微生物多樣性具有一定的影響，發(fā)病程度越高，魔芋根際土壤真菌的多樣性越高。重度發(fā)病區(qū)土壤中叢赤殼屬(Nectriaspp.)、芽孢桿菌屬和短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)的數(shù)量分別是輕度發(fā)病區(qū)的1.22～32.57倍。

表 2 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤微生物的豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)

2.2.4 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤微生物的數(shù)量和種類 從圖3看出，不同發(fā)病程度魔芋根際土壤中獲得微生物的堿基數(shù)和序列數(shù)、微生物總量和種類均存在一定的差異。1) 堿基數(shù)和序列數(shù)。堿基數(shù)為15.14×106～15.80×106bp，呈中度>輕度>重度；序列數(shù)為71.12×103～72.93×103條，呈輕度>中度>重度；堿基數(shù)和序列數(shù)各發(fā)病程度土壤間無顯著差異。2) 微生物總量。發(fā)病程度越高土壤中真菌的數(shù)量越多，中度發(fā)病區(qū)(71.40×103OTUs)、重度發(fā)病區(qū)(72.33×103OTUs)較輕度發(fā)病區(qū)土壤中真菌數(shù)量(70.49×103OTUs)分別增加2.61%、1.29%；3個(gè)發(fā)病程度間無顯著差異。細(xì)菌數(shù)量呈輕度>重度>中度，輕度顯著高于中度，其余處理間差異不顯著。古細(xì)菌數(shù)量呈中度>輕度>重度，各處理間差異不顯著。3) 微生物種類。古細(xì)菌種類為9～14種，發(fā)病程度越高土壤中特有古細(xì)菌的種類越少，呈輕度>中度>重度；魔芋土壤特有真菌的種類以中等發(fā)病區(qū)最多，為114種，分別較輕度發(fā)病區(qū)(37種)和重度發(fā)病區(qū)(53種)多208.11%和115.09%；魔芋土壤特有細(xì)菌的種類以重度發(fā)病區(qū)最多，為98種，分別較輕度發(fā)病區(qū)(72種)和重度發(fā)病區(qū)(59種)多36.11%和66.10%。

注：A，所有微生物的堿基數(shù)和序列數(shù)；B，微生物總量；C，特有微生物的種類。

2.2.5 不同發(fā)病程度魔芋根際土壤有益微生物的差異 從圖4看出，不同發(fā)病程度魔芋根際土壤中微生物所占的比例不同，有益微生物和有害微生物在土壤微生物中的比例隨病害程度的變化而變化，魔芋根際土壤中有益真菌包括被孢霉屬(Mortierellaspp.)和叢赤殼屬(Nectriaspp.)；有益細(xì)菌包括能促進(jìn)植物生長或抑制病原菌生長的芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、具有固氮作用的短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)和芽單胞菌屬(Gemmatimonasspp.)以及能產(chǎn)生抑制病原菌生長的次生代謝物的放線菌門內(nèi)的Gaiellalesspp.；有害微生物包括鐮刀菌屬(Fusariumspp.)等。隨發(fā)病程度加深，有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)數(shù)量呈遞增趨勢(shì)；且重度發(fā)病區(qū)土壤中叢赤殼屬(Nectriaspp.)數(shù)量是輕度發(fā)病區(qū)的32.57倍，芽孢桿菌屬數(shù)量是輕度發(fā)病區(qū)的1.22倍，短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)數(shù)量是輕度發(fā)病區(qū)的1.31倍。

注：A，真菌組間差異；B，細(xì)菌組間差異；C，古細(xì)菌組間差異。

3 討論

自2017年以來，魔芋市場(chǎng)需求旺盛，價(jià)格飛漲，加工企業(yè)對(duì)原材料需求量陡增，但魔芋生產(chǎn)基地發(fā)展滯后，魔芋加工原料十分短缺，無法滿足企業(yè)的基本生產(chǎn)需求[25]。之后的幾年，魔芋市場(chǎng)仍供不應(yīng)求，因制約魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素即土傳病害一直未得到有效解決[26]。隨著土壤微生態(tài)逐漸被人們所了解，越來越多的研究從單純的拮抗藥劑或拮抗微生物的篩選轉(zhuǎn)向通過作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的角度摸索土傳病害的防治方法，并取得一定的研究成果。研究發(fā)現(xiàn)，選擇健康優(yōu)質(zhì)的土地進(jìn)行種植，可減少有害菌數(shù)量[27]，種植期間通過改變種植方式(套種、間種、林下種植及輪作等)調(diào)節(jié)作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，使土壤中有益菌群保持相對(duì)平衡，進(jìn)而減少土傳病害的發(fā)生[28]；還可通過減少種植年限，不重茬種植，減少土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量以及致病菌所占土壤根際微生物總量的比例，達(dá)到減少病害發(fā)生的概率[29]。研究還發(fā)現(xiàn)，植物在生長過程中常常將許多營養(yǎng)物質(zhì)分配至根部，并通過其根系向周圍環(huán)境釋放大量的單糖、多糖、有機(jī)酸、氨基酸、酚類化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)和能源物質(zhì)，吸引大量微生物聚集[30-32]，這些微生物可通過抗生或誘導(dǎo)植物防御等作用抵御病原菌的侵染[33-34]，對(duì)植物起到保護(hù)作用。研究表明，魔芋根際微生態(tài)對(duì)土傳病害的發(fā)生有一定的影響，同時(shí)魔芋根系也會(huì)分泌一定的物質(zhì)招募大量微生物抵御病原菌的侵染，具體的互作機(jī)理尚不清楚。TRIVEDI等[35]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黃龍病菌(Candidatusliberbacterasiaticus)侵染柑橘后會(huì)改變柑橘根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，并增加放線菌的聚集。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著魔芋莖腐病發(fā)病程度加深，魔芋根際土壤中有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬數(shù)量也隨之增加。與TRIVEDI等[35]的研究結(jié)果相似。在該研究中，有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬的數(shù)量受魔芋莖腐病發(fā)病程度的影響，是魔芋根系還是鐮刀菌分泌的某種物質(zhì)吸引其聚集，還是其他不可知的原因，還需深入研究。且魔芋植株遭到病害侵襲時(shí)上述有益微生物是否協(xié)助防御，并通過有益微生物調(diào)控魔芋根際微生物區(qū)系，減輕魔芋莖腐病的發(fā)生等也需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

魔芋莖腐病發(fā)病程度對(duì)其土壤pH和養(yǎng)分含量存在一定的差異；魔芋發(fā)病程度對(duì)其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有一定的影響，其中細(xì)菌和古細(xì)菌的豐富度表現(xiàn)為輕度>中度>重度，真菌多樣性表現(xiàn)為輕度<中度<重度；魔芋發(fā)病程度對(duì)其根際土壤中獲得微生物的堿基數(shù)和序列數(shù)、微生物總量和種類也存在一定的影響作用，發(fā)病程度越高獲得的序列數(shù)以及特有的古細(xì)菌數(shù)越少；魔芋發(fā)病程度對(duì)其根際有益微生物的種類和數(shù)量也存在一定的影響，其中有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)數(shù)量隨發(fā)病程度加重呈遞增趨勢(shì)。土壤中叢赤殼屬、芽孢桿菌屬和短根瘤菌屬的數(shù)量重度發(fā)病區(qū)為輕度發(fā)病區(qū)的1.22～32.57倍。