花櫚木種子際促生真菌的分離篩選及鑒定

王婷婷，韋小麗

(1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省林業(yè)學(xué)校，貴州 修文 550210)

“種子際”是一個(gè)短暫、迅速變化、微生物動(dòng)態(tài)的土壤帶，是距離種子1～10 mm受種子萌發(fā)影響的土壤。種子際微生物是種子落地后接觸到的最原始微生物群落。目前大量研究證實(shí)了植物種子表面蘊(yùn)藏著多種微生物群落[1]，但其中大部分研究主要針對(duì)農(nóng)作物種子進(jìn)行，分離出的種子際微生物主要有細(xì)菌(芽孢桿菌、伯克霍爾德氏菌、微桿菌、短小桿、菌泛菌、假單胞菌等)、真菌(木霉屬、鐮刀菌屬)、放線菌[2-3]，而對(duì)林木種子際真菌研究鮮有報(bào)道。

花櫚木(Ormosiahenryi)屬蝶形花科紅豆屬，為國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。其木材是高檔家具、雕刻和珍貴裝飾品的用材?；澳緲湫蚊烙^，種子鮮紅美麗，是優(yōu)良的園林綠化樹種，且其根、根皮、莖及葉均可藥用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[4]。前人對(duì)花櫚木種子多樣性及萌發(fā)特性[5-6]、根瘤菌多樣性[7]，育苗技術(shù)[8-11]、繁殖生態(tài)學(xué)特征[12]進(jìn)行了研究，對(duì)種子際真菌分離的研究未有報(bào)道。

花櫚木硬實(shí)種子比例高，在進(jìn)行花櫚木育苗時(shí)，通常采用高溫浸種使種皮吸脹或機(jī)械損傷種皮再浸種催芽，這一方面使種子產(chǎn)生吸脹損傷，另一方面操作不便。在自然環(huán)境中，我們發(fā)現(xiàn)在環(huán)境條件好的地方花櫚木能更新萌發(fā)，但自然環(huán)境中卻沒有高溫處理，這可能是微生物及環(huán)境共同作用的結(jié)果。因此本研究擬以貴州晴隆、關(guān)嶺、三穗3個(gè)地方采集花櫚木種子際土壤為研究對(duì)象，參考根際微生物研究方法[13]，對(duì)種子際真菌進(jìn)行分離、純化，篩選同時(shí)具有溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)IAA促生功能的真菌。通過生物學(xué)鑒定，確定促生真菌的種類，為花櫚木種子際微生物多樣性研究奠定基礎(chǔ)，為促進(jìn)花櫚木種子萌發(fā)、幼苗生長研究提供具有促生功能的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在貴州晴隆縣、三穗縣、關(guān)嶺縣3處野生花櫚木群落采集距花櫚木種子表面1～10 mm土壤。采集方法是：將林下的花櫚木種子和包裹花櫚木種子1～10 mm的土壤一起采集，帶回實(shí)驗(yàn)室再將種子際土壤進(jìn)行分離。由于種子際土壤微生物是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的，因此本研究將種子附著微生物動(dòng)態(tài)過程分為5類，且各類型種子獨(dú)立存在，無包含關(guān)系，各類型的特征如下(圖1)：

圖1 分離種子際微生物的5種種子類型

第1類種子(a)：該類種子來自土層厚度0～1 cm土壤，該類種子顏色鮮艷、較少土壤附著在種子表面、種臍清晰新鮮。代表最初接觸地面的一類種子，表面附著的土壤可作為最初接觸的微生物分離。

第2類種子(b)：花櫚木種子來自于2～5 cm土壤。該類種子顏色紅色、無光澤、附著的土壤較多、種臍不明顯；這類種子在土壤中埋藏時(shí)間較久，種子際微生物是種子貯藏在土壤中時(shí)接觸的微生物，可作為種子在萌發(fā)前所接觸的土壤微生物分離。

第3類種子(c)：附著菌絲的花櫚木種子，是從5～20 cm土壤深處找到的比較特殊的一類種子，其特征是種子未發(fā)芽但種子表面包裹著1層菌絲，土壤附著在表面。

第4類種子(d)：是從5～20 cm土壤中找到的已經(jīng)吸脹的花櫚木種子，種子呈黑紅色、種子吸脹變大、有的種皮破裂，其種子際土壤用來種子分離吸脹階段種子所共生的土壤微生物。

第5類種子(e)：已經(jīng)萌發(fā)露出胚根和胚芽的花櫚木種子，從5～20 cm土層中采集，是已經(jīng)完成萌發(fā)的花櫚木種子，該類種子特點(diǎn)是：胚根胚芽已經(jīng)長出，胚乳明顯可見，子葉未展開，種皮完全消失。其種子際土壤用來分離種子萌發(fā)后所共生的土壤微生物。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子際土壤真菌的分離純化 采用稀釋涂布平板法[14]，取0.5 g種子際土壤制成懸濁液，各類型種子際土壤取3個(gè)樣本；分別稀釋至10-1、10-2、10-3，各梯度重復(fù)3個(gè)，涂布在直徑9 cm培養(yǎng)皿中，采用PDA固體培養(yǎng)基。從培養(yǎng)種子際土壤微生物的培養(yǎng)基中，將生長出的菌絲再次分離至新的PDA固體培養(yǎng)基中，不斷分離直到獲得純的菌落為止。

1.2.2 真菌的功能篩選 固氮能力篩選：用打孔器從純化好的真菌培養(yǎng)基上取0.5 cm大小的菌餅，再接種至阿須貝氏固體培養(yǎng)基[15]，每個(gè)菌種3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3個(gè)菌餅置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察菌絲生長情況，初步判定出待測菌株是否具有固氮功能；能生長的菌種說明具有固氮作用，不能生長的則不具備固氮功能。

溶磷能力篩選，用打孔器在純化好的真菌培養(yǎng)基取0.5 cm大小的菌餅，再接種至無機(jī)磷培養(yǎng)基[15]，每個(gè)菌種3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3個(gè)菌餅置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，根據(jù)溶磷圈直徑(HD)與菌圈直徑(CD)的比值大小來初步判定溶磷能力的強(qiáng)弱；HD/CD值越大說明溶磷功能越強(qiáng)，值越小說明溶磷功能越弱。

解鉀能力篩選，用打孔器在純化好的真菌培養(yǎng)基上取0.5 cm大小的菌餅，再接種至PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，具體操作是在PDA培養(yǎng)基一側(cè)均勻撒上少量的鉀長石粉粉末，另一側(cè)則接種真菌，每種菌做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3個(gè)菌餅置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。以菌絲的生長方向、生長速度、菌落形態(tài)等指標(biāo)初步判定菌種的解鉀能力，菌絲能在鉀長石粉趨向生長說明具有解鉀能力，不能向鉀長石粉擴(kuò)散生長則說明無解鉀能力。

產(chǎn)IAA能力篩選，選用Salkowski法，用打孔器將純化好的真菌制成0.5 cm大小的菌餅，將5個(gè)菌餅接種至含有L-色氨酸(200 mg/mL)的金氏培養(yǎng)基(King’s)培養(yǎng)中，每個(gè)菌種做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3個(gè)菌餅置于30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)5 d；結(jié)束后取菌懸液2 mL，8000 r/min離心10 min，取上清液于試管中，加入等體積的Salkowski比色液，避光靜置30 min使其顯色，顏色變紅后說明菌種具有產(chǎn)IAA功能，配制3-吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液，在530 nm波段下測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方差y=47.96x-5.401 8(R2=0.956 9)，根據(jù)公式計(jì)算得出IAA(MG/L)的值[15]。

1.2.3 促生菌的鑒定 生物學(xué)鑒定：分離純化后的菌株用真菌基因組DNA提取試劑盒(Biomiga)提取DNA，PCR擴(kuò)增采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[17]，擴(kuò)增菌株核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列(internal transcribed spacer，ITS)。將PCR擴(kuò)增純化后的產(chǎn)物委托重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，鑒定出種子際中具有促生功能的菌種。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離純化結(jié)果

通過對(duì)貴州晴隆、三穗、關(guān)嶺3個(gè)地點(diǎn)的種子際真菌的分離純化，最終得出了16株真菌(表1)。種子際真菌中有7株真菌來自關(guān)嶺、5株真菌來自晴隆、4株真菌來自三穗，其中2株來自于上述的第3類種子際土壤，9株來自第4類種子際土壤、5株來自第5類種子際土壤。

表1 真菌的分離純化結(jié)果

2.2 真菌的功能篩選

對(duì)已分離純化的16種菌株進(jìn)行促生功能篩選，結(jié)果表明(表2)：12株真菌具有解鉀功能，13株真菌具有固氮功能，10株真菌具有溶磷功能，HD/CD(溶磷圈與菌圈的比值)排名前3的菌種是GL-4-1(1.9 mm)、SS-1-3(1.5 mm)、SS-2-3(1.38 mm)；10株真菌具有產(chǎn)IAA功能，產(chǎn)IAA能力排名前3的菌種是SS-1-3(25.644)、GL-3-1(12.423)、QL-3-5(12.407)。GL-1-1、QL-3-1的IAA值比不接菌的空白菌液測定值低，故不作為具備產(chǎn)IAA功能的真菌。選擇同時(shí)具有解鉀、固氮、溶磷、產(chǎn)IAA功能的菌種作為回接菌種，故選定了6種真菌，分別為QL-3-5、GL-3-1、GL-4-1、SS-1-3、SS-1-6、SS-2-3，待回接真菌的溶磷圈見圖2。

表2 種子際真菌的促生功能篩選

圖2 用于回接的真菌的溶磷圈

2.3 真菌的鑒定結(jié)果

根據(jù)PCR擴(kuò)增的700 bp片段長度的菌株DNA基因序列，參考李發(fā)虎等[16]研究方法對(duì)6種菌種基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)6種真菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，種子際微生物SS-1-6為青霉屬Penicilliumsp.、SS-2-3為擬康寧木霉Trichodermakoningiopsis、SS-1-3為莖霉屬Chaunopycnissp.、QL-3-5為產(chǎn)黑色素短梗霉Aureobasidiummelanogenum、GL-4-1為菌核青霉Penicilliumsclerotiorum、GL-3-1為被孢霉屬M(fèi)ortierellasp.。

圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的6種促生菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

從貴州晴隆、三穗、關(guān)嶺的花櫚木種子際土壤共分離出16株真菌，篩選出6株同時(shí)具備4種促生功能的真菌，鑒定S-1-6、SS-2-3、SS-1-3、QL-3-5、GL-4-1和GL-3-1，結(jié)果分別為青霉屬(Penicilliumsp.)、擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)、莖霉屬(Chaunopycnissp.)、產(chǎn)黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)、菌核青霉(Penicilliumsclerotiorum)和被孢霉屬(Mortierellasp.)，說明花櫚木種子際真菌比較豐富，且主要出現(xiàn)在種子吸脹前、吸脹后和萌發(fā)階段。

從貴州3個(gè)不同地點(diǎn)的種子際土壤中分離出16株真菌，第1類和第2類種子際中未分離出真菌，原因可能是由于花櫚木種皮堅(jiān)硬，未開始吸水膨脹，沒有代謝產(chǎn)物為真菌提供基本生長營養(yǎng)，因此真菌無法同種子共生。第3類僅分離出2株、第4類9株、第5類5株，可見在種子吸脹待萌發(fā)階段，種子際真菌種類最多。通過促生功能的篩選，篩選出6株同時(shí)具有溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)IAA促生功能的真菌。根據(jù)生物學(xué)鑒定，最終確定該6株種子際真菌，分別是來自三穗SS-1-6青霉屬、SS-2-3擬康寧木霉、SS-1-3莖霉屬；來自晴隆的QL-3-5產(chǎn)黑色素短梗霉和來自關(guān)嶺GL-4-1菌核青霉、GL-3-1被孢霉屬。本研究分離出的促生真菌SS-1-6青霉屬、SS-2-3木霉屬(擬康寧木霉)，這2個(gè)屬與前人從種子際中分離的菌屬一致[2、18]，由于前人研究的菌種只鑒定到屬，因此與本研究分離的菌種不一定相同，其余菌種SS-1-3莖霉屬、QL-3-5產(chǎn)黑色素短梗霉、GL-3-1被孢霉屬是前人未從種子際中分離出的真菌。本研究只從少數(shù)樣點(diǎn)采樣就分離到了16株花櫚木種子際真菌，可見花櫚木種子際微生物很豐富，今后應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大采樣點(diǎn)，深入探討花櫚木種子際微生物(包括真菌、細(xì)菌和放線菌)的多樣性，從中篩選出更多的促生菌。由于在第1、第2類種子際土壤中未分離出真菌，是否有其他類型的微生物與之共生有待于進(jìn)一步研究；在種子脫落到萌發(fā)過程中，種子際微生物群落是如何發(fā)展演替的也是今后進(jìn)一步研究的課題。