甜櫻桃新矮化砧木“吉塞拉12號”組培快繁技術(shù)研究

張煥玲，趙 斐，康如如，賈小明*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省林業(yè)科學(xué)院，陜西 西安 710082)

甜櫻桃(Prunusavium)是世界范圍廣泛栽培且廣受歡迎的水果，營養(yǎng)豐富、酸甜可口、色澤明亮、風(fēng)味獨特、耐儲運，有“果中珍品”“寶石水果”和“黃金水果”等美譽[1-2]。櫻桃既可實生播種繁殖，也可通過扦插、嫁接、壓條和根糵等方法進行繁殖[2-3]。目前，世界上甜櫻桃生產(chǎn)都采用嫁接苗建園，砧木的栽培性狀、抗逆和抗病蟲性能等直接關(guān)系到甜櫻桃栽培成功與否，因此推廣優(yōu)良砧木，對甜櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有十分重要的意義[4-5]?！凹?Gisela)12號”矮化砧木是德國研究人員以灰毛葉櫻桃(P.canescens)和歐洲酸櫻桃(P.clerasus)作親本采用雜交方法培育的三倍體甜櫻桃“Gisela”系列砧木之一[6]，在美國西部甜櫻桃產(chǎn)區(qū)應(yīng)用較多，我國于近幾年從美國引進。該砧木根系密度大，固地性強，嫁接樹結(jié)果早產(chǎn)量高，能較長期保持樹體正常生長和果實品質(zhì)，完全克服了被廣泛應(yīng)用的Gisela 5號、6號砧木存在的結(jié)果盛期后樹勢衰弱嚴(yán)重、果實口感變差、嫁接部位“小腳”病嚴(yán)重、固地性差、易倒伏、需配置立柱支撐等缺點[4,6-7]，是應(yīng)用前景非常好的優(yōu)良甜櫻桃新矮化砧木，但該砧木壓條、扦插繁殖困難[6]，生產(chǎn)中資源嚴(yán)重不足。因此，開展Gisela 12號組培快繁技術(shù)研究，可為其及相關(guān)樹種工廠化育苗、基因工程改良奠定基礎(chǔ)。

櫻桃組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)80年代，以芽、莖段和葉片等器官培養(yǎng)研究居多，技術(shù)相對成熟。代紅艷等[8]選用中國櫻桃的6個品種，研究了莖尖大小、接種方式、培養(yǎng)基成分等對莖尖誘導(dǎo)成苗率的影響。侯義龍等[9]以櫻桃砧木Colt帶芽莖段為外植體，研究了適合增殖和生根培養(yǎng)的激素配比。在Gisela系列砧木中，馮社章等[10]、殷麗青等[11]分別以頂芽、半木質(zhì)化莖段為外植體研究了Gisela 6號的組培快繁技術(shù)，均選用MS或改良MS和1/2MS(生根培養(yǎng))為基本培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)涉及的激素有6-BA、TDZ和IBA、NAA，以6-BA和IBA使用較多，生根培養(yǎng)涉及的激素均為IBA和NAA，研究篩選出的激素搭配各不相同。目前鮮見關(guān)于Gisela 12號組織培養(yǎng)的報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究取Gisela 12號2年生苗頂芽作為外植體，苗木由陜西省果樹苗木繁育中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 在生長季末大田采集Gisela 12號頂芽，用少許洗滌液浸洗1～2 min后，用自來水沖洗30 min。接種前，在70%的酒精溶液中浸泡20 s，0.1% HgCl2中消毒不同時間(設(shè)置6、8、10、12 min 4個處理)后，無菌水沖洗5～6次，用手術(shù)刀剝除頂芽外部數(shù)層鱗片，接種在MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中，在溫度(25±2)℃，光照強度2 000 lx，16 h/d條件下培養(yǎng)。每瓶接1個外植體，每處理接種10瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)45 d以后，統(tǒng)計污染率和死亡率。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)獲得的無菌芽剪成1～2 cm的莖段，接種在MS添加不同濃度6-BA(設(shè)置0.2、0.5、0.8 mg/L 3個濃度梯度)與IBA(設(shè)置0.2、0.3、0.4 mg/L 3個濃度梯度)組合共9種增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段，重復(fù)2次，培養(yǎng)45 d以后，統(tǒng)計每個外植體上增殖的芽數(shù)和增殖率。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)中獲得的長為1～3 cm的無根苗頂芽剪取1～2 cm，接種在1/2MS單獨添加 IBA和NAA(分別設(shè)置0.2、0.5、0.8 mg/L 3個濃度梯度)，以及IBA與NAA組合(0.2 mg/L IBA+0.8 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA、0.8 mg/L IBA+0.2 mg/L 3種組合)共9種生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。每個處理接種10瓶，每瓶接2個芽，重復(fù)2次。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計試管苗的生根率、根長和根粗等指標(biāo)。

1.2.4 煉苗移栽 當(dāng)試管苗長出2～4條1～3 cm新根時，將培養(yǎng)瓶瓶蓋松開透氣鍛煉7 d后移栽。移栽基質(zhì)為常規(guī)育苗輕基質(zhì)，移栽容器為5 cm口徑10 cm高度的塑料育苗穴盤，配有深度10 cm的塑料蓋。先將基質(zhì)加少許水潤濕，攪拌至手捏成團松開即散時裝盤，然后用鑷子小心取出幼苗，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，將根剪至2～3 cm長進行移栽。移栽后澆足水，蓋上蓋子，于(25±2)℃、自然光照條件下培養(yǎng)至成活，觀察紀(jì)錄幼苗生長狀況，20 d后統(tǒng)計幼苗成活率和株高測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 將獲得的數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010進行匯總，SPSS Statistics 20軟件對統(tǒng)計結(jié)果進行方差分析和處理各水平間的差異性檢驗，其中對污染率和增殖率作反正弦轉(zhuǎn)換、對增殖系數(shù)作對數(shù)轉(zhuǎn)化后分析。增殖率=增殖芽數(shù)≥2的外植體數(shù)/接種的外值體數(shù)，增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種外值體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒與初代培養(yǎng)

外植體消毒是初代培養(yǎng)的關(guān)鍵，會影響外植體的正常生長，也決定著無菌材料的獲取效率，進而影響后續(xù)研究進度，對科研生產(chǎn)造成一定的損失。試驗結(jié)果(圖1)表明，用0.1%的升汞消毒，隨消毒時間增加，污染率呈降低趨勢，由8 min的18.2%降至12 min的3.6%。但隨著消毒時間延長，對外植體的傷害也隨之出現(xiàn)，因初代培養(yǎng)所選外植體為頂芽，消毒后接種時要將外面幾層鱗片剝?nèi)?，芽?nèi)部組織因受外層鱗片保護，消毒劑對其傷害并不嚴(yán)重。消毒10 min時，有1.4%的外植體死亡，12 min時，也只有2.1%的外植體死亡。方差分析結(jié)果顯示，12 min以內(nèi)的死亡率無顯著性差異(P>0.05)，但12 min的污染率和4、6、8 min的污染率存在顯著性差異(P<0.05)，故Gisela12號頂芽初代培養(yǎng)消毒時間以0.1% HgCl2消毒12 min為宜。

圖1 HgCl2消毒時間對初代培養(yǎng)的影響

初代培養(yǎng)時，分別選取增殖培養(yǎng)基設(shè)計中6-BA和IBA的中間濃度組合作為初代培養(yǎng)基，即MS附加0.5 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA，發(fā)現(xiàn)在該培養(yǎng)基中Gisela 12號頂芽均能100%正常萌發(fā)，說明其組培性能較好，加之頂芽初代培養(yǎng)相當(dāng)于微型扦插，基本培養(yǎng)基成分基本能滿足頂芽萌發(fā)的營養(yǎng)要求，對激素要求不嚴(yán)。

2.2 增殖培養(yǎng)

2.2.1 6-BA 對增殖的影響 當(dāng)IBA濃度一定時，增殖率和增殖系數(shù)與6-BA濃度成正相關(guān)，隨6-BA濃度增加，增殖率和增殖系數(shù)逐漸增大(圖2)。只有當(dāng)IBA 0.2 mg/L 時，6-BA 0.5 mg/L與0.8 mg/L處理增殖率和增殖系數(shù)差異不顯著(P>0.05)，分別為86.96%、85.62%和4.29、4.68。其余IBA濃度下，均是0.8 mg/L 6-BA濃度下的增殖率和增殖系數(shù)最高，且與0.2、0.5 mg/L 6-BA濃度下的差異達顯著水平(P<0.05)。

圖2 6-BA對Gisela12號增殖的影響

2.2.2 IBA對增殖的影響 當(dāng)6-BA濃度一定時，增殖率和增殖系數(shù)均表現(xiàn)出隨IBA濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(圖3)，0.2、0.3、0.4 mg/L IBA中，以0.3 mg/L IBA濃度下增殖最好。盡管0.2、0.8 mg/L 6-BA濃度中，0.3、0.4 mg/L IBA與之結(jié)合使用的增殖系數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但在其他激素組合中，0.2、0.3、0.4 mg/L IBA濃度下增殖率、增殖系數(shù)均達顯著水平(P<0.05)。

圖3 IBA對Gisela12號增殖的影響

研究發(fā)現(xiàn)，IBA只影響增殖芽的數(shù)量，對增殖芽質(zhì)量影響不大，而6-BA不但影響增殖數(shù)量，也顯著影響增殖質(zhì)量。在0.2 mg/L 6-BA濃度條件下增殖的叢生長勢弱，葉色發(fā)黃，在0.5 mg/L和0.8 mg/L 6-BA濃度條件下增殖的叢生芽長勢良好，葉色濃綠(圖4)。

注:A.0.2 mg/L 6-BA; B.0.5 mg/L 6-BA; C.0.8 mg/L 6-BA。

2.3 生根培養(yǎng)

2.3.1 IBA單獨使用對生根的影響 0.2 mg/L IBA不能誘導(dǎo)生根，0.5～0.8 mg/L IBA可以誘導(dǎo)生根，且隨著IBA濃度增加，生根時間縮短，生根率、根長呈增加趨勢(圖5)，生根率普遍比單獨使用NAA要高，但根粗不如單獨使用NAA好，且根直接從莖基部發(fā)出，細長、無愈傷組織形成。方差分析表明，IBA濃度對生根率的影響達顯著水平(P<0.05)，對根長和根粗影響不顯著(P>0.05)。

圖5 IBA對生根的影響

研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間對IBA誘導(dǎo)試管苗生根很關(guān)鍵，培養(yǎng)45 d時，在含0.5 mg/L和0.8 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，無菌芽生根率分別為0.0%和7.5%，培養(yǎng)至60 d時，2種培養(yǎng)基中無菌芽生根率分別增至50.0%和64.5%，這可能與外源激素在試管苗細胞內(nèi)的積累有關(guān)。

2.3.2 NAA單獨使用對生根的影響 0.2～0.8 mg/L范圍的NAA均可誘導(dǎo)生根，生根率隨NAA濃度增加呈現(xiàn)先增后降趨勢(圖6)，生根率普遍較單獨使用IBA低，最高只有28.56%,但與單獨使用IBA時誘導(dǎo)的根相比根較粗(圖7)。0.5、0.8 mg/L NAA在生根率、根粗和根長方面差異不顯著(P>0.05)，但在根長方面差異顯著(P<0.05)，0.5 mg/L NAA顯著優(yōu)于0.8 mg/L NAA，前者平均根長為4.68 cm，后者為2.20 cm。隨著NAA濃度的增加，莖基部愈傷組織呈現(xiàn)增多趨勢。

圖6 NAA對生根的影響

2.3.3 IBA與NAA聯(lián)合使用對生根的影響 NAA和IBA不同濃度組合比單獨生長素處理生根效果好，莖基部無或少有愈傷組織產(chǎn)生，且根長明顯比單獨使用生長素要長(圖7)。IBA0.5 mg/L和NAA0.5 mg/L組合處理試管苗生根率、根長達到最大值60.83%、7.15 cm，IBA0.2 mg/L和NAA0.8 mg/L組合處理根粗達到試驗中最大值0.25 cm(圖8)。差異性分析表明，3種生長素組合處理在根粗方面差異不顯著(P>0.05)，但生根率與根長差異達顯著水平(P<0.05)，且IBA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L與IBA0.2 mg/L+NAA0.8 mg/L組合處理生根率顯著高于IBA0.8 mg/L+NAA0.2 mg/L組合處理(P<0.05)。

注:A.單獨使用IBA; B.單獨使用NAA；C.IBA和NAA聯(lián)合使用。

圖8 生長素組合對生根的影響

2.4 煉苗移栽

試驗結(jié)果顯示，Gisela12號試管苗移栽對培養(yǎng)基質(zhì)要求不嚴(yán)，普通商品用育苗輕基質(zhì)中移栽成活率可達100%(圖9)。培養(yǎng)室開瓶蓋7 d后移栽2 d后發(fā)現(xiàn)試管苗葉片略有枯萎變黃，移栽4 d后發(fā)現(xiàn)偶有新葉發(fā)出，9 d后全部試管苗均有新葉發(fā)出，20 d后移栽成活率為97.84%，苗高在3.5 cm～8 cm，平均高為5.37 cm，少數(shù)葉片葉緣泛黃，出現(xiàn)斑塊狀失綠癥狀，但在后期生長中逐漸恢復(fù)。

圖9 普通育苗輕基質(zhì)中移栽成活情況

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

以Gisela 12號2年生苗頂芽為外植體，系統(tǒng)研究篩選了初代培養(yǎng)消毒時間、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基和煉苗移栽方法，結(jié)果表明，0.1% HgCl2消毒12 min，可有效控制頂芽外植體的污染率和死亡率。頂芽外植體在MS附加0.5 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基中能100%正常萌發(fā)。

在0.8 mg/L范圍內(nèi)，6-BA濃度與無菌芽增殖率和增殖系數(shù)成正相關(guān)，且會影響增殖芽質(zhì)量；在0.4 mg/L范圍內(nèi)，IBA濃度對無菌芽增殖率和增殖系數(shù)的影響呈先升后降趨勢，IBA對增殖芽質(zhì)量影響不大；最佳增殖培養(yǎng)基為MS附加0.8 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA。

生根培養(yǎng)中生長素聯(lián)合使用效果優(yōu)于單獨使用。單獨使用IBA時，只有濃度>0.2 mg/L才能誘導(dǎo)生根，生根率比單獨使用NAA要高，但根粗不如單獨使用NAA好。NAA濃度>0.5 mg/L時不利生根，且隨著NAA濃度增加，莖基部愈傷組織呈現(xiàn)增多趨勢，不利移栽成活。研究篩選的最佳生根培養(yǎng)基為MS附加0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA。

Gisela 12號試管苗移栽對栽培基質(zhì)要求不嚴(yán)，普通育苗輕基質(zhì)在保持濕度和良好的透氣條件下，移栽成活率可達95 %以上。

3.2 討論

外植體消毒是建立無菌體系的關(guān)鍵，HgCl2是組織培養(yǎng)中普遍使用的消毒劑，植物種類、消毒劑消毒時間受外植體類型、外植體帶菌程度影響，最佳消毒時間確定取決于試驗中外植體的污染率和死亡率[12]。本研究選用Gisela 12號頂芽為外植體，消毒后接種時要將外層芽鱗剝?nèi)ィ蟠蠼档土斯x子對頂芽內(nèi)層組織的傷害，故選取較長的12 min消毒處理，死亡率升高并不明顯，又可大大降低污染率，但在選取莖段和葉片等作為外植體時，長時間12 min的消毒處理需要慎重考慮。

研究篩選出MS+6-BA0.8 mg/L+IBA0.3 mg/L為Gisela12號無菌芽的最佳增殖培養(yǎng)基，說明芽的增殖及其生長狀況不僅取決于6-BA和IBA絕對含量的高低，且與二者的比例有十分重要關(guān)系，適宜的6-BA與IBA濃度配比既有利于不定芽的增殖又能使試管苗長勢健壯[12]。在6-BA濃度一定的條件下，增殖率和增殖系數(shù)均表現(xiàn)出隨IBA的增長出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，說明高濃度的生長素對不定芽的增殖起到了一定程度的抑制作用。大部分生長素效應(yīng)的濃度/活性曲線都是鐘形的，低濃度效應(yīng)隨濃度的升高而增加，濃度過高則會起到抑制生長的作用，由于較高生長素濃度增加了乙烯的產(chǎn)生[12]。在IBA濃度一定的條件下，隨6-BA濃度增加，無菌芽的增殖率和增殖系數(shù)逐漸增加，研究篩選出的6-BA增殖濃度為最高濃度，因此在后續(xù)研究中可繼續(xù)增加6-BA的濃度范圍，觀察芽的增殖狀況。

生根培養(yǎng)研究表明，單獨使用IBA生根率普遍比單獨使用NAA要高，且愈傷組織生根少，但根粗不如單獨使用NAA好，而NAA處理下的試管苗莖基部易產(chǎn)生直徑0.5～1.0 cm團塊狀愈傷組織，愈傷組織過多會阻塞莖和根之間的維管束，影響物質(zhì)傳輸[12]。這說明不同生長素在生根性能誘導(dǎo)方面功能并不完全一致，本研究表明結(jié)合使用生長素可提高生根率及根系質(zhì)量。

Gisela 12號試管苗移栽對培養(yǎng)基質(zhì)要求不嚴(yán)，影響移栽成活的關(guān)鍵因素是濕度與基質(zhì)中氧氣含量。在濕度為70%～80%、基質(zhì)保持良好透氣條件下，試管苗移栽20 d后，成活率可達95%以上，這與他人的研究結(jié)果不太相同[8,10-11]，可能與移栽容器及濕度控制方法有關(guān)。