外周血生物標志物與PD-1/PD-L1抑制劑治療肺癌療效的相關性

柯萍，江波，何文杰，涂長玲，聶俊，朱穎，尹慶，孫蕊柱

0 引言

肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤[1]，晚期肺癌的治療已進入以免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）為代表的治療時代，但實際上免疫治療的獲益人群僅占晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的20%左右[2]。PD-L1、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden,TMB）等一系列臨床現(xiàn)有的指導免疫治療用藥的生物標志物未能滿足篩選免疫治療獲益群體的需求，因此需要進一步探索更加經(jīng)濟、便捷的指標。外周血液學檢測技術簡便，可以實現(xiàn)腫瘤實時監(jiān)測及預后判斷，因此，外周血生物標志物的發(fā)展前景巨大[3]。炎性反應細胞可促進腫瘤發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞絕對值（absolute neutrophil count,ANC）、淋巴細胞計數(shù)（absolute lymphocyte count,ALC）、嗜酸性粒細胞計數(shù)（absolute eosinophil count,AEC）與ICI治療的預后相關[4]。癌細胞通過許多生長因子、趨化因子、白細胞介素與微環(huán)境進行通訊，研究顯示IL-6、C反應蛋白（C-reaction protein,CRP）與免疫治療的療效有關[5]。但這些研究還處于初步探索階段，因此本研究回顧性分析臨床指標和外周血指標與肺癌患者接受ICI治療療效的相關性，以期探索預測免疫治療療效的指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2021年1月在昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院接受PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療的200例肺癌患者資料，包括籍貫、性別、年齡、吸煙狀態(tài)、病理類型、臨床分期、有無肝轉移、ICI的選用情況、治療線數(shù)、治療方案、表皮酪氨酸激酶受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變狀態(tài)、免疫治療前及免疫治療兩周期后外周血指標。

1.2 研究方法

外周血指標由云南省腫瘤醫(yī)院檢驗科進行檢測，項目包括CD45CD3、CD4/CD8、ANC（109/L）、ALC（109/L）、單核細胞絕對值（absolute monocytes count,AMC）（109/L）、血小板（platelet,PLT）（109/L）、NLR、淋巴細胞/單核細胞比值（lymphocyte-to-monocyte ratio,LMR）、血小板/淋巴細胞比值（platelet-to-lymphocyte ratio,PLR）、堿性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）（u/L）、LDH（u/L）、纖維蛋白原（fibrinogen,FIB)（u/L）、γ-干擾素（interferon-γ,IFN-γ）(pg/ml)、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor,TNF)（pg/ml）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）（pg/ml）。

PD-1抑制劑：納武利尤單抗、帕博利珠單抗、信迪利單抗、特瑞普利單抗、卡瑞利珠單抗；PD-L1抑制劑：阿特珠單抗、德瓦魯單抗。

免疫聯(lián)合治療模式：免疫單藥、免疫聯(lián)合化療、免疫聯(lián)合抗血管治療、免疫聯(lián)合化療聯(lián)合抗血管治療。

1.3 療效評價

免疫治療兩周期后進行評價，包括胸部增強計算機斷層掃描（computed tomography,CT）以及轉移部位影像學檢查。按照實體瘤客觀療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST）1.1版進行療效評估，分為完全緩解（complete response,CR）、部分緩解（partial response,PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）及疾病進展（progressive disease,PD），計算客觀緩解率（objective response rate,ORR）及疾病控制率（disease control rate,DCR）。PFS定義為治療開始到疾病進展或者死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對臨床指標和外周血指標進行回顧性數(shù)據(jù)分析。療效分析中，單因素分析采用χ2檢驗,多因素分析采用Logistic回歸分析，受試者工作曲線（ROC）計算聯(lián)合指標的曲線下面積（AUC），探究聯(lián)合指標對免疫治療療效的預測價值。生存分析中，單因素分析采用Kaplan-Meier方法，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。治療前后外周血液學指標與療效相關性采用非參數(shù)檢驗中兩個相關樣本的Wilcoxon方法進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床特征

本研究共入組200例患者，臨床指標與免疫治療療效相關性見表1。

表1 入組患者臨床指標與免疫治療療效的相關性Table 1 Correlation between clinical indicators and efficacy of immunotherapy on included patients

2.2 外周血指標與免疫治療療效的關系

2.2.1 單因素分析 收集外周血指標，取其中位數(shù)為臨界值，結果顯示，NLR≤2.81與DCR有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），LDH≤202.5 u/L與DCR有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。其余指標與療效之間并無明顯相關性，見表2。

表2 入組患者外周血指標與免疫治療療效的相關性Table 2 Correlation between peripheral blood indexes and curative effect of immunotherapy on included patients

2.2.2 多因素分析 將影響療效的單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量因素納入Logistic多因素回歸分析模型，包括有無肝轉移、PD-1/PD-L1抑制劑、免疫治療線數(shù)、免疫治療方案、NLR、LDH。DCR為反應變量。結果顯示，無肝轉移、免疫聯(lián)合化療、NLR≤2.81、LDH≤202.5 u/L的療效更佳，見表3。

表3 入組患者免疫治療療效及預后的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of curative effect and prognosis of included patients

2.2.3 聯(lián)合指標對療效的預測價值 將療效的多因素分析中有意義的NLR與LDH指標進行聯(lián)合，使用Logistic回歸分析求出預測概率P，最后對P進行ROC曲線面積分析。結果顯示，NLR聯(lián)合LDH的AUC為0.698（95%CI:0.595～0.801）（P=0.001），見圖1。

圖1 NLR聯(lián)合LDH對DCR的預測價值Figure 1 Predictive value of NLR combined with LDH on DCR

2.3 臨床指標及外周血指標與預后的關系

2.3.1 單因素分析 所有患者中位PFS為7.3月，無肝轉移患者較肝轉移患者PFS明顯延長（10.7月vs.2.7月，P=0.000）；接受一線免疫治療的患者較接受三線及以上治療的患者PFS明顯延長（9.3月vs.5.4月，P=0.042）；接受免疫聯(lián)合化療治療的患者較免疫單藥治療的患者PFS明顯延長（9.3月vs.4.7月，P=0.038）；免疫治療前LDH≤202.5 u/L的患者較LDH＞202.5 u/L的患者PFS明顯延長（10.7月vs.6.4月，P=0.031），見圖2。

圖2 入組患者臨床指標及預后指標與PFS的相關性Figure 2 Correlation between clinical indicators,prognostic indicators and PFS of included patients

2.3.2 多因素分析 將單因素分析中有意義的指標納入Cox多因素生存分析，包括有無肝轉移、免疫治療線數(shù)、免疫治療方案、LDH。結果顯示，無肝轉移、LDH≤202.5 u/L的患者的PFS更長，見表3。

2.4 免疫治療前后外周血指標變化與療效的相關性

對各療效組治療前后外周血指標進行分析，結果顯示，部分緩解組（PR）：ANC、PLT、NLR、FIB、LDH、IL-6在兩周期治療后較治療前明顯下降（P＜0.05）；無緩解組（SD+PD）：ANC、PLT、NLR、FIB在兩周期治療后較治療前降低（P＜0.05）。疾病控制組（PR+SD）：ANC、PLT、NLR、FIB在兩周期治療后較治療前明顯下降（P＜0.05）；疾病進展組（PD）：ALP在兩周期治療后較治療前明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 不同分組免疫治療前后的外周血指標 (中位數(shù))Table 4 Peripheral blood indexes of different groups before and after immunotherapy (median)

3 討論

ICI在肺癌的治療中已經(jīng)取得了重大的成果。目前，腫瘤組織PD-L1表達含量是比較公認的療效預測標志物[6-8]，TMB在近幾年的指南中也被列為免疫療法的推薦檢測方法[9]，然而上述療效預測標志物卻受限于腫瘤組織的獲取。外周血液與原發(fā)腫瘤具有同源性，且操作簡單易于實時評估，潛在的臨床應用價值高。因此，探索外周血生物標志物預測免疫治療的療效很有必要。

研究表明[10]，慢性炎性反應能夠抑制機體免疫反應相關途徑，促進腫瘤轉移，外周血細胞可一定程度上反映機體免疫狀態(tài)的動態(tài)變化。腫瘤細胞的生長會產生乳酸，LDH參與催化此過程[11]。一項薈萃分析評估1 700例接受PD-1/PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者NLR的預測和預后價值，結果表明血液NLR升高與患者PFS和OS縮短相關[12]。本研究與Diem等[13]研究結果顯示的高NLR聯(lián)合高LDH可能是NSCLC免疫治療療效的負性預測因子一致。一項薈萃分析納入1 136例接受免疫治療的晚期NSCLC患者，顯示LDH升高的患者PFS和OS相對較短[14]。本研究中也觀察到免疫治療前LDH≤202.5 u/L的患者較LDH＞202.5 u/L的患者PFS明顯延長（中位PFS 10.7vs.6.4月，P=0.031）。

既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內TNF-α含量明顯升高，是促進腫瘤的生長、擴散及血管生成的重要因子[15]。IFN-γ主要來源于活化的T細胞和NK細胞[16-17]，可增強機體抗腫瘤能力。IL-6可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促炎作用[18]。本研究中未觀察到IFN-γ、TNF-α、IL-6指標與療效預后的相關性，可能與樣本量偏少有關。T細胞在腫瘤免疫過程中起主導作用[19]，在腫瘤微環(huán)境中可辯識腫瘤原位或外周血中的抗原表位的CD8+T細胞常常被消滅[20]，進而使腫瘤逃逸宿主免疫系統(tǒng)。本研究中未觀察到CD45CD3、CD4/CD8與療效預后的相關性，也可能與樣本量偏少有關。

本研究進一步探索了外周血指標的變化與療效的關系，顯示部分緩解組ANC、PLT、NLR、FIB、LDH、IL-6在兩周期免疫治療后較治療前大幅度下降，差異有統(tǒng)計學意義；疾病控制組ANC、PLT、NLR、FIB在兩周期免疫治療后較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；疾病進展組ALP在兩周期治療后較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。本研究中納入了免疫聯(lián)合化療的病例，考慮到化療的不良反應也會引起ANC、PLT、IL-6指標的下降，因此，本研究僅認為NLR、LDH的變化與免疫治療的療效相關。

化療藥物使腫瘤細胞死亡，釋放免疫原性物質，激活cGAS-STING途徑[21]，產生抗腫瘤免疫反應，而抗血管生成藥物參與腫瘤微環(huán)境的調節(jié)[22]，研究[7,23-24]發(fā)現(xiàn)免疫治療與其他治療聯(lián)合后可以更好地發(fā)揮治療作用。本研究顯示免疫聯(lián)合化療相較于免疫單藥有更好的療效。接受免疫聯(lián)合化療的患者較免疫單藥的患者PFS明顯延長（中位PFS 9.3月vs.4.7月，P=0.038）。研究顯示ICI早期介入治療患者有明顯的生存獲益。本研究也觀察到接受一線免疫治療的患者較接受三線及以上治療的患者PFS明顯延長（中位PFS 9.3月vs.5.4月，P=0.042）。

綜上所述，NLR≤2.81、LDH≤202.5 u/L、無肝轉移、免疫聯(lián)合化療與免疫治療療效呈正相關，其中NLR與LDH聯(lián)合預測療效的價值更高，且無肝轉移、LDH≤202.5 u/L是免疫治療的獨立預后因素。另外，探索性研究結果提示外周血指標NLR、LDH的變化與PD-1/PD-L1抑制劑的療效相關。

本研究存在一定局限性：首先，本研究為回顧性研究，由于各方面因素，大部分病例無法獲得OS，因此，僅對PFS展開研究，并且達到終點事件的患者僅90例（45%），未達到終點事件的患者中有34例（17%）失訪；其次，混雜因素多，樣本量小，未進行進一步的分層分析，未來需要更多前瞻性臨床研究來證實。