EB病毒感染與早期鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者療效及預(yù)后的關(guān)系

許恬，楊露，袁芳琴，何俠，尹麗

0 引言

結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種較為常見的淋巴瘤亞型，約占我國(guó)所有非霍奇金淋巴瘤的6.4%[1]。大多數(shù)結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤起源于上呼吸消化道[2]，被稱為結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤（extranodal nasal-type natural killer/T-cell lymphoma,ENKTCL）。多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)為早期，且與EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染密切相關(guān)[3]。

EBV在ENKTCL中主要表現(xiàn)為Ⅱ型潛伏感染及病毒基因高表達(dá)，可以通過(guò)EBER原位雜交檢測(cè)[4]。目前有研究認(rèn)為EBV DNA水平升高與不良預(yù)后相關(guān)[5-7]，但也有報(bào)道[8-9]認(rèn)為治療前EBV DNA水平對(duì)預(yù)后沒有影響。感染EB病毒的細(xì)胞能夠表達(dá)多種抗原，其中衣殼抗原（capsid antigen,VAC）和早期抗原（early antigen,EA）是最常見的兩種抗原。兩者相對(duì)應(yīng)的抗體VCA-IgA和EA-IgA已廣泛應(yīng)用于鼻咽癌的早期輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)[10]，而EA-IgA和VCA-IgA升高對(duì)于ENKTCL的預(yù)后價(jià)值少有報(bào)道。因此，本研究回顧性分析了南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院早期ENKTCL患者治療前EBV DNA載量、治療前血清EA-IgA、VCA-IgA抗體水平與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為早期ENKTCL預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例入組

本研究回顧性分析了2011—2018年南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科收治的早期結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理活檢和免疫組織化學(xué)確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤；（2）Ann Arbor分期為ⅠE、ⅡE期；（3）原發(fā)部位為鼻腔、鼻咽等上呼吸消化道；（4）初治患者；（5）有治療前血漿EBV DNA載量、治療前血清VCA-IgA及EA-IgA抗體水平資料；（6）臨床隨訪資料完整；（7）無(wú)重要臟器功能不全或其他腫瘤。最終符合入組條件的患者為78例。本研究獲得江蘇省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料收集

收集患者一般臨床資料：性別、年齡、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）評(píng)分、B癥狀。腫瘤相關(guān)檢查資料：治療前后的血常規(guī)、生化常規(guī)、EBV DNA、EB病毒抗體等血液學(xué)檢測(cè)；鼻咽及頸部MRI、胸腹部CT、骨掃描、PET-CT等影像學(xué)資料，并進(jìn)行治療前骨髓穿刺排除骨髓侵犯。臨床分期根據(jù)2014年Lugano修訂的Ann Arbor分期原則。再分期由高年資放療科醫(yī)師結(jié)合影像學(xué)資料進(jìn)行。乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase,LDH）升高定義為L(zhǎng)DH≥245 u/L。原發(fā)部位定義為單個(gè)解剖部位，包括鼻腔、鼻咽、副鼻竇等結(jié)外部位。原發(fā)腫瘤侵襲（primary tumor invasion,PTI）定義為原發(fā)腫瘤從原發(fā)部位向鄰近結(jié)構(gòu)或組織生長(zhǎng)，或同時(shí)累及多個(gè)連續(xù)部位。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

全血標(biāo)本離心分離血漿后，用EB病毒核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定血漿EBV DNA水平，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將混合好的PCR反應(yīng)液在ABI 7300PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)步驟：93℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；55℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照SOP文件執(zhí)行，當(dāng)質(zhì)控品在控時(shí)結(jié)果有效，EBV DNA表達(dá)量＜1.0×102copies/ml被視為陰性。采用EB病毒抗體檢測(cè)試劑盒（德國(guó)IBL公司）通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定VCA-IgA、EA-IgA抗體滴度，檢測(cè)結(jié)果≥12 u/ml為陽(yáng)性。

1.4 治療方案

早期ENKTCL患者以接受放化療綜合治療為主。模式包括：?jiǎn)渭兎暖?、序貫放化療（放?化療、化療+放療）、“三明治”治療（化療+放療+化療）、同步放化療。所有患者均接受調(diào)強(qiáng)放射治療（intensity-modulated radiotherapy,IMRT），采用6MV-X直線加速器。中位照射劑量為54 Gy（44～65 Gy）。使用擴(kuò)大受累野放療，腫瘤區(qū)（gross tumor volume,GTV）定義為影像學(xué)及內(nèi)窺鏡檢查所見的原發(fā)腫瘤和陽(yáng)性淋巴結(jié)。高危亞臨床靶區(qū)（clinical target volume,CTV）依據(jù)原發(fā)部位、分期決定。原發(fā)腫瘤局限于鼻腔，CTV包括雙側(cè)鼻腔、雙側(cè)前組篩竇、硬腭和上頜竇；原發(fā)腫瘤超出鼻腔，應(yīng)擴(kuò)大至受累的鄰近器官或結(jié)構(gòu)，如后鼻孔受侵，應(yīng)包括鼻咽。ⅠE期原發(fā)鼻腔ENKTCL不做頸淋巴結(jié)預(yù)防照射，ⅡE期患者CTV包括雙頸淋巴結(jié)引流區(qū)。ⅠE-ⅡE期鼻腔外上呼吸消化道ENKTCL原則上均行頸淋巴結(jié)預(yù)防照射。

化療方案包括蒽環(huán)類及非蒽環(huán)類藥物。蒽環(huán)類方案包括CHOP（環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、潑尼松）、EPOCH（依托泊苷、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、潑尼松）；非蒽環(huán)類方案包括P-GEMOX（左旋門冬酰胺酶、吉西他濱、奧沙利鉑）、P-GDP（左旋門冬酰胺酶、吉西他濱、順鉑、地塞米松）、GDP（吉西他濱、順鉑、地塞米松）、SMILE（甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、地塞米松、左旋門冬酰胺酶、依托泊苷）、MESA（甲氨蝶呤、依托泊苷、地塞米松、培門冬酶）。中位化療周期數(shù)為4個(gè)周期（1～11個(gè)周期）。

1.5 療效評(píng)估及隨訪

近期療效評(píng)價(jià)根據(jù)WHO實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST）分為：完全緩解（complete remission,CR）、部分緩解（partial remission,PR）、疾病穩(wěn)定（stability disease,SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）。無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）定義為疾病診斷至進(jìn)展、死亡或末次隨訪的時(shí)間?？偵嫫冢╫verall survival,OS）定義為疾病診斷至死亡或末次隨訪時(shí)間。所有患者在治療結(jié)束后1月隨訪，兩年內(nèi)每3月隨訪1次，第3～5年每半年隨訪1次，5年后每年隨訪1次。隨訪內(nèi)容主要包括體格檢查、血常規(guī)、生化、腫瘤標(biāo)志物、EBV DNA、EBV抗體等血液學(xué)檢查，以及頭頸部MRI、胸腹部CT等影像學(xué)檢查。所有患者隨訪截止日期為2020年12月31日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)對(duì)臨床基線資料進(jìn)行分析。將患者的性別、年齡、Ann Arbor分期、ECOG評(píng)分、有無(wú)B癥狀、EBV DNA、VCA-IgA及EA-IgA抗體滴度首次治療有無(wú)CR、臨床檢驗(yàn)指標(biāo)等納入單因素分析。單因素分析使用Kaplan-Meier生存分析，采用Log rank檢驗(yàn)生存結(jié)局指標(biāo)。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床基線特征

全組患者臨床特征見表1。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，我們共納入78例早期結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，中位年齡為50歲（14～81歲）。原發(fā)部位以鼻腔為主（78.2%），17例（21.8%）發(fā)生于鼻腔外上呼吸消化道，主要包括鼻咽、副鼻竇、扁桃體等。ⅡE患者中32例患者（91.4%）為區(qū)域淋巴結(jié)受累，2例患者無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)受累但出現(xiàn)縱隔淋巴結(jié)受累，1例無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)受累但同時(shí)出現(xiàn)鎖骨上、縱隔及腋窩淋巴結(jié)受累。

與EBV陰性組相比，EBV陽(yáng)性與Ann Arbor分期（P=0.012）、原發(fā)部位（P=0.044）、PTI（P=0.039）顯著相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)與性別、年齡、ECOG評(píng)分、B癥狀、LDH、血紅蛋白顯著相關(guān)。VCA-IgA、EA-IgA陽(yáng)性率分別為20.5%、14.1%，VCA-IgA、EA-IgA分別與EBV DNA顯著相關(guān)（P=0.023,0.038）。

2.2 治療情況

全組患者中，12例（15.4%）接受單純放療，36例（46.2%）接受序貫治療，24例（30.8%）接受化療+放療+化療的“三明治”治療，6例（7.8%）接受同步放化療。所有患者接受了IMRT，中位照射劑量為54 Gy（44～65 Gy）。僅有3例（3.8%）患者接受＜50 Gy照射。37例ⅠE期原發(fā)鼻腔ENKTCL未做頸淋巴結(jié)預(yù)防照射，有1例ⅠE期原發(fā)鼻腔ENKTCL患者行頸淋巴結(jié)預(yù)防照射，ⅡE期患者均行頸淋巴結(jié)引流區(qū)。ⅠE-ⅡE期鼻腔外上呼吸消化道ENKTCL患者行頸淋巴結(jié)預(yù)防照射。

66例患者接受了含蒽環(huán)類、非蒽環(huán)類藥物為主的化療。其中，12例接受蒽環(huán)類方案化療（CHOP、EPOCH），4例患者在CHOP方案基礎(chǔ)上加入左旋門冬酰胺酶（P-CHOP），36例接受非蒽環(huán)類化療，14例患者因療效不佳、經(jīng)濟(jì)原因、藥物過(guò)敏等原因更換方案。

2.3 近期療效與遠(yuǎn)期生存情況

中位隨訪時(shí)間為58.8月（3.0月～164.23月）。全組患者治療后達(dá)CR者67例（85.9%），PR者7例（9.0%），SD者3例（3.8%），PD者1例（1.3%）。EBV DNA、VCA-IgA、EA-IgA陽(yáng)性分別與治療后未獲得CR（P=0.035、0.027、0.043）相關(guān)，見表1。全組死亡患者15例，12例死于腫瘤，3例死于其他疾病。全組患者3、5年P(guān)FS分別為81.7%、74.0%，3、5年OS分別為87.9%、81.1%。

表1 結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床基線資料(n(%))Table1 Clinical baseline data of extranodal nasal-type natural killer/T-cell lymphoma (ENKTCL) patients (n(%))

2.4 單因素與多因素分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡≥60歲、ECOG評(píng)分≥2分、原發(fā)鼻腔外上呼吸消化道、EBV DNA陽(yáng)性、VCA-IgA陽(yáng)性、EA-IgA陽(yáng)性、治療后未獲得CR與不良的OS密切相關(guān)；年齡≥60歲、ECOG評(píng)分≥2分、Ann Arbor分期ⅡE、原發(fā)鼻腔外上呼吸消化道、PTI、EBV DNA陽(yáng)性、VCA-IgA陽(yáng)性、EAIgA陽(yáng)性、頸部淋巴結(jié)未預(yù)防性照射、治療后未獲得CR則與較差的PFS顯著相關(guān)，見圖1、表2。

表2 早期ENKTCL患者OS和PFS單因素分析Table 2 Univariate analysis of for OS and PFS of patients with early-stage ENKTCL

圖1 不同EBV DNA(A,B)、EA-IgA(C,D)和VCA-IgA(E,F)水平下78例早期ENKTCL患者的生存分析Figure 1 Survival analysis of 78 patients with early-stage ENKTCL at different levels of EBV DNA(A,B),EA-IgA(C,D) and VCA-IgA(E,F)

為糾正可能存在的混雜因素，我們將單因素分析中P＜0.2的自變量納入多因素分析。全組患者中，年齡≥60歲（P=0.033）、EBV DNA（P=0.004）、治療后未獲得CR（P=0.002）為早期ENKTCL的OS的獨(dú)立預(yù)后因素，年齡≥60歲（P=0.031）、EBV DNA（P=0.036）、原發(fā)鼻腔外上呼吸消化道（P=0.009）、治療后未獲得CR（P=0.001）則為早期ENKTCL的PFS的獨(dú)立預(yù)后因素，見表3。

表3 早期ENKTCL患者OS和PFS多因素分析Table 3 Multivariate analysis of OS and PFS of patients with early-stage ENKTCL

3 討論

與鼻咽癌相似，EBV在ENKTCL中為Ⅱ型潛伏感染，不表達(dá)針對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的EBNA2和EBNA3基因[11]，從而具有逃避宿主免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。外周血循環(huán)EBV DNA部分來(lái)源于壞死和凋亡的腫瘤細(xì)胞，EBV DNA拷貝水平可能與腫瘤增殖水平有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)治療前EBV DNA陽(yáng)性的ENKTCL患者常表現(xiàn)為更晚的分期、結(jié)外受累、B癥狀及LDH水平升高[12-13]。與文獻(xiàn)報(bào)道相似，本研究中EBV DNA陽(yáng)性與Ann Arbor分期晚相關(guān)。原發(fā)腫瘤傾向于通過(guò)黏膜延伸至鄰近結(jié)構(gòu)或組織，PTI作為局部腫瘤負(fù)荷指標(biāo)已被多項(xiàng)研究證實(shí)為預(yù)測(cè)ENKTCL預(yù)后的重要因素[14-15]。本研究認(rèn)為EBV DNA陽(yáng)性與PTI相關(guān)，即EBV陽(yáng)性患者傾向于具有局部腫瘤侵襲特征。本研究未發(fā)現(xiàn)EBV DNA與B癥狀、LDH有相關(guān)性，與文獻(xiàn)報(bào)道不符?？赡茉?yàn)椋海?）樣本量較少；（2）本研究只納入早期ENKTCL患者，ⅠE期與ⅡE期腫瘤負(fù)荷差異可能不明顯。本研究認(rèn)為與原發(fā)鼻腔上呼吸消化道相比，原發(fā)鼻腔外上呼吸消化道患者的EBV陽(yáng)性比例更高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P值接近0.05。而有研究認(rèn)為ENKTCL的原發(fā)部位與EBV DNA無(wú)關(guān)[9]，但該研究?jī)H比較鼻腔與鼻腔外部位，未單獨(dú)對(duì)鼻腔、鼻腔外上呼吸消化道與EBV DNA的差異進(jìn)行探究。未來(lái)進(jìn)一步探索上呼吸消化道發(fā)病部位不同所致臨床特征、EBV DNA水平及預(yù)后差異十分必要。

EBV DNA水平與短期療效相關(guān)。有研究報(bào)道治療前血漿EBV DNA含量低于1.0×104copies/ml的ENKTCL患者對(duì)于治療的總體應(yīng)答率顯著高于血漿EBV DNA含量高于1.0×104copies/ml患者[16]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前EBV DNA陰性患者的CR率顯著高于陽(yáng)性患者，有更好的治療反應(yīng)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符。治療前EBV-DNA對(duì)于ENKTCL預(yù)后的預(yù)測(cè)作用存在爭(zhēng)議。既往多數(shù)研究均認(rèn)為治療前EBV DNA水平升高與不良預(yù)后有關(guān)。Su等[17]研究發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)log[EBV DNA]≥3.8有較差的PFS和OS。Liang等[18]的一項(xiàng)前瞻性研究檢測(cè)了32例ENKTCL患者EBV-DNA載量，發(fā)現(xiàn)治療前EBV-DNA陽(yáng)性是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但也有研究顯示治療前EBV-DNA水平對(duì)早期ENKTCL患者的預(yù)后沒有影響。Wang等[8]使用PCR法前瞻性檢測(cè)治療前后血漿樣本中EBV-DNA的含量，結(jié)果表明治療前EBV-DNA水平不是預(yù)測(cè)PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素，而治療后血漿EBV DNA水平可以預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)和不良預(yù)后。Wang等[19]檢測(cè)了99例ENKTCL患者治療前、中、后的EBV DNA，發(fā)現(xiàn)EBV DNA陰性患者的3年P(guān)FS、OS均顯著優(yōu)于EBV DNA陽(yáng)性患者。因此動(dòng)態(tài)檢測(cè)EBV拷貝數(shù)對(duì)于ENKTCL的預(yù)后具有一定意義。本研究對(duì)78例患者進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，治療前EBV DNA陽(yáng)性是PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。但由于納入的患者僅部分在后續(xù)隨訪中進(jìn)行了EBV DNA檢測(cè)，未能對(duì)治療后EBV DNA與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行分析。

VCA、EA產(chǎn)生的抗體為分泌型抗體，主要參與鼻黏膜免疫反應(yīng)[20]。在鼻咽癌中，VCA-IgA和EA-IgA聯(lián)合檢測(cè)可以應(yīng)用于早期篩查[21]，與臨床分期密切相關(guān)[22]。而VCA-IgA和EA-IgA對(duì)于鼻咽癌患者的預(yù)后價(jià)值還存在爭(zhēng)議[23]。VCA-IgA、EA-IgA在ENKTCL中的研究較少。Huang等[4]首次報(bào)道了VCA-IgA、EA-IgA與ENKTCL患者預(yù)后的相關(guān)性。該研究發(fā)現(xiàn)EBV EA-IgA≥1:10、VCAIgA≥1:160與LDH升高、區(qū)域淋巴結(jié)累及、分期晚相關(guān)，并且OS和PFS較差。其中，EA-IgA≥1:10是OS的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.008），與較低的CR率（P=0.001）和較高的復(fù)發(fā)率（P=0.016）有關(guān)。且本研究中EA-IgA、VCA-IgA的陽(yáng)性率分別為20.5%、14.1%，兩者與EBV DNA陽(yáng)性有關(guān)，與其他臨床特征均未見相關(guān)性。EA-IgA、VCAIgA陰性患者有較好的治療反應(yīng)。單因素分析發(fā)現(xiàn)EA-IgA、VCA-IgA滴度陽(yáng)性有較差的PFS、OS，但多因素分析顯示EA-IgA、VCA-IgA均不是影響PFS、OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究EA-IgA、VCAIgA抗體滴度臨界值低于Huang等[4]的研究，可能造成結(jié)果差異；Huang等將VCA-IgA滴度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)降至陽(yáng)性1:40后同樣發(fā)現(xiàn)與臨床特征及預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。由此，我們猜想較高水平的抗體滴度表明EBV感染處于裂解增殖期，EBV相關(guān)癌蛋白的過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為更具侵襲性的克隆，預(yù)后較差。較低滴度的VCA-IgA、EA-IgA對(duì)于ENKTCL預(yù)后預(yù)測(cè)作用不大，高滴度臨界值選取及其對(duì)于ENKTCL的作用需要進(jìn)一步研究，兩者聯(lián)合檢測(cè)能否提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性也有待探究。另外，本研究?jī)H有少部分患者（11例）放療后進(jìn)行EB病毒檢測(cè)，治療后EB病毒動(dòng)態(tài)變化對(duì)于預(yù)后的意義也值得進(jìn)一步分析。

本研究還存在一些局限性：首先，本研究為小樣本量的回顧性研究，結(jié)果可能需要在更大規(guī)模的隊(duì)列研究中進(jìn)行驗(yàn)證；其次，不同實(shí)驗(yàn)室EBV DNA、EB病毒抗體的檢測(cè)方法及臨界值不同，導(dǎo)致結(jié)果存在差異。另外，本研究納入患者來(lái)自華東地區(qū)，研究結(jié)果是否可以外推到其他人群還有待探討。

綜上，治療前EBV DNA陽(yáng)性與較晚的Ann Arbor分期、PTI、原發(fā)鼻腔外上呼吸消化道、治療反應(yīng)差有關(guān)，治療前EBV DNA陽(yáng)性是PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。EA-IgA、VCA-IgA水平升高與EBV DNA陽(yáng)性、治療反應(yīng)差有關(guān)，與其他臨床特征無(wú)相關(guān)性。EA-IgA、VCA-IgA均不是影響PFS、OS的獨(dú)立因素。治療前EBV DNA可用于ENKTCL的風(fēng)險(xiǎn)分層及預(yù)后預(yù)測(cè)，而EA-IgA、VCA-IgA對(duì)于ENKTCL的預(yù)后指導(dǎo)作用有限。