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    基于星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的OPC制備技術(shù)探索

    2021-12-07 04:46:06許雯銥李聰慧楊俊林
    關(guān)鍵詞:小鼠

    楊 瑩,許雯銥,2,李聰慧,2,楊俊林,2

    (1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 311121; 2. 浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 311121)

    少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte,OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包裹軸突形成髓鞘的大膠質(zhì)細(xì)胞,它們負(fù)責(zé)產(chǎn)生髓鞘,并且在保持軸突完整性以及電脈沖沿軸突快速有效傳導(dǎo)等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用.少突膠質(zhì)細(xì)胞由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分化成熟而來[1].OPCs是一種潛在的干細(xì)胞,能分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成[2].同時(shí),OPCs是脫髓鞘病變中髓鞘再生的主要種子細(xì)胞[3],因此,它們除了被廣泛用于脫髓鞘疾病致病機(jī)理的研究之外,在移植治療脫髓鞘疾病方面也具有廣闊的應(yīng)用前景[4].此外,OPCs在發(fā)育過程中參與維持血腦屏障的完整性,其移植可以減少血腦屏障的滲漏,是治療缺血性腦卒中的新途徑[5].OPCs移植到受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還可以治療脊髓損傷[6].目前,小鼠OPCs主要通過培養(yǎng)小鼠大腦皮層組織獲得[7],但是所獲OPCs的數(shù)量和質(zhì)量依賴于培養(yǎng)時(shí)所使用的胎牛血清,即使同一品牌的血清也存在批次間的差異,常常使得OPC的制備充滿不確定性[4],導(dǎo)致小鼠OPC的制備充滿挑戰(zhàn)性[8].鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育過程中能夠分泌一些生長因子來促進(jìn)OPCs的存活和增殖[7],如PDGFaa、bFGF、EGF等,本研究擬利用這一特點(diǎn),探索建立一種比較穩(wěn)定的OPC制備體系,以滿足對OPCs日益增長的需要.

    1 材料和方法

    1.1 材料

    ICR新生小鼠(P0);D/F20S培養(yǎng)基(79% DMEM/F-12培養(yǎng)基;20%胎牛血清;1% Penicillin-Streptomycin(雙抗));星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ACM)、抗體、24孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等.

    1.2 小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)

    解剖、獲得ICR小鼠大腦皮層組織的方法參考已有的文獻(xiàn)報(bào)道[9],所有實(shí)驗(yàn)程序都按照實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用的準(zhǔn)則進(jìn)行,該準(zhǔn)則得到了杭州師范大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn).簡要概括如下:首先對ICR新生小鼠噴灑70%乙醇后于4 ℃冰箱中低溫麻醉,然后取出小鼠再次噴乙醇消毒.用剪刀剪下小鼠腦袋,置于盛有1×PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中,洗去多余的血液,然后于一新的盛有1×PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中解剖出小鼠大腦皮層,用鑷子將皮層組織上的腦膜輕輕撕除.將大腦皮層轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中,用鑷子將大腦皮層夾碎成約1 mm3大小的組織塊,加入適量的D/F20S培養(yǎng)基后接種于包被有PDL的T75培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),前兩天不移動培養(yǎng)瓶,保證組織能夠更好地貼壁.2 d后,首次更換新鮮培養(yǎng)液,之后隔天換液,直到細(xì)胞長至匯合.

    1.3 ACM的制備

    等上述小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合,將培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖培2 h,去除小膠質(zhì)細(xì)胞,去上清后換上新鮮培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱中額外培養(yǎng)2 h以上,以平衡培養(yǎng)體系的pH值.然后再次置于搖床上以250 r/min的轉(zhuǎn)速搖過夜(12~15 h),通過去掉培養(yǎng)上清的方式去除OPCs,從而達(dá)到純化小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的目的[10].接著向培養(yǎng)瓶中加入普通培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞4 d[4],使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌足夠多的生長因子到培養(yǎng)液中,收獲培養(yǎng)上清之后經(jīng)孔徑為0.22 μm的過濾器過濾即得到ACM.

    1.4 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備

    按照1.3中所描述的方法去除新生小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)物中的小膠質(zhì)細(xì)胞和OPCs,然后用0.05%的胰蛋白酶將培養(yǎng)瓶中的星形膠質(zhì)細(xì)胞消化下來,經(jīng)臺盼藍(lán)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)之后,按照6×104個(gè)/cm2的密度接種活細(xì)胞到細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)[11],過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁.第2天更換培養(yǎng)基,除去未貼壁的細(xì)胞,然后加入20 μg/mL的絲裂霉素處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h,使其停止細(xì)胞分裂[4,12],即獲得純化處理的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層.

    1.5 小鼠大腦皮層組織消化成單細(xì)胞

    經(jīng)解剖獲得小鼠大腦皮層,于培養(yǎng)皿中將其剪碎成約1 mm3大小的組織塊,加入0.05%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min,期間每隔5 min用1 mL移液槍的槍頭吹打液體.15 min后加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化[7],之后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,丟棄上清液,加10 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min.重復(fù)此操作2~3次后,加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞懸液用孔徑為70 μm的濾網(wǎng)過濾,除去組織碎塊,得到單細(xì)胞懸液.

    1.6 免疫熒光染色

    吸出培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基,在孔內(nèi)加入4% PFA對細(xì)胞進(jìn)行固定,用以保護(hù)細(xì)胞形態(tài),避免細(xì)胞變質(zhì)[13].30 min后吸出PFA,用1×PBS洗3遍,每遍10 min.然后加入封閉液(含10%山羊血清和0.1% Triton的PBS)后靜置1 h,封閉非特異性表位.隨后吸出封閉液,加入一抗,在通透性試劑存在條件下,保證一抗接近細(xì)胞核內(nèi)的表位[14],4 ℃過夜以保證抗體與目標(biāo)表位充分結(jié)合.第2天,用1×PBS洗3遍.然后加入針對一抗宿主物種并且有熒光標(biāo)記的二抗和DAPI[15],室溫避光孵育1 h.去掉二抗之后加入1×PBS洗3遍,每遍10 min.從每個(gè)條件所對應(yīng)的培養(yǎng)孔內(nèi)隨機(jī)選取3個(gè)視野,用熒光顯微鏡拍照,然后對DAPI、SOX10陽性(SOX10+)信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得出SOX10+細(xì)胞數(shù)目與DAPI數(shù)目的比值.所使用到的抗體包括:小鼠抗GFAP 抗體(anti-GFAP,1∶1 000),用于標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞;豚鼠抗SOX10抗體(anti-SOX10,1∶400),用于標(biāo)記OPCs.

    2 研究結(jié)果

    2.1 ACM促進(jìn)小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)獲得OPCs

    為了驗(yàn)證ACM對通過小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)制備OPCs的方式是否有促進(jìn)作用,設(shè)置了兩種實(shí)驗(yàn)條件:在包被有PDL的24孔板中,分別用D/F20S培養(yǎng)基(對照組)和ACM(實(shí)驗(yàn)組)培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞,再比較這兩種條件下OPCs形成過程及數(shù)目的差異.在培養(yǎng)至第6天時(shí),在顯微鏡下可觀察到明顯差異,ACM組中OPC樣的細(xì)胞明顯多于對照組.繼續(xù)培養(yǎng)至第8天,固定細(xì)胞做細(xì)胞免疫熒光染色,染色結(jié)果顯示ACM組SOX10+OPCs數(shù)目明顯多于對照組(圖1A),統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明ACM組SOX10+OPCs占到細(xì)胞總數(shù)的13.90%,而對照組SOX10+OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的5.03%,且二者之間存在顯著性差異(圖1B).另外還觀察到ACM組的孔內(nèi)OPCs分布均勻,培養(yǎng)孔的每個(gè)區(qū)域都有OPCs的存在,而對照組OPCs則呈集群狀分布,只有少部分區(qū)域有OPCs的存在.

    A:D/F20S組和ACM組代表性圖片;B:D/F20S組和ACM組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*表示P<0.05,以下同).

    2.2 ACM促進(jìn)小鼠皮層組織塊制備OPCs

    將小鼠大腦皮層切碎成1 mm3大小的組織碎塊,接種于包被有PDL的24孔板中,分別用D/F20S培養(yǎng)基(對照組)和ACM(實(shí)驗(yàn)組)進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)至第6天時(shí),在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ACM組OPC樣的細(xì)胞明顯多于對照組.培養(yǎng)至第8天時(shí)的免疫熒光染色結(jié)果顯示,ACM組SOX10+OPCs數(shù)目明顯多于對照組(圖2A),其OPCs占細(xì)胞總數(shù)的26.17%,而對照組OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的7.17%(圖2B),差異顯著(P<0.05).這些結(jié)果說明,ACM在用小鼠大腦皮層組織塊培養(yǎng)制備OPCs的方法中也同樣具有促進(jìn)作用.

    A:D/F20S組和ACM組代表性圖片;B:D/F20S組和ACM組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

    2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層促進(jìn)單細(xì)胞培養(yǎng)法制備OPCs

    將小鼠大腦皮層組織塊消化成單細(xì)胞后接種于星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層之上,用D/F20S培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),以無飼養(yǎng)層培養(yǎng)作為對照.培養(yǎng)至第8天,免疫熒光染色結(jié)果顯示飼養(yǎng)層組SOX10+OPCs占細(xì)胞總數(shù)的10.30%,而對照組孔內(nèi)的OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的5.03%,單因素方差分析結(jié)果表明兩組差異顯著(P<0.05),說明小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對OPCs的形成具有促進(jìn)作用(圖3).然而相較于上述ACM培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞所獲的OPC產(chǎn)率(約13.90%),星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層支持OPCs產(chǎn)生的作用不如ACM.

    A:有或無星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞獲得OPCs的代表性圖片;B:兩組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

    2.4 ACM與星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層協(xié)同促進(jìn)OPC的制備

    以小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層協(xié)同ACM或D/F20S培養(yǎng)基對小鼠大腦皮層單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)至第8天,經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色后拍照,對2個(gè)組SOX10+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,ACM與飼養(yǎng)層組的SOX10+OPCs占細(xì)胞總數(shù)的16.87%,高于星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層下以D/F20S為培養(yǎng)基的培養(yǎng)組(10.30%),二者之間存在顯著性差異(圖4).這一結(jié)果說明當(dāng)ACM和星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層共同應(yīng)用時(shí),對OPCs產(chǎn)生的促進(jìn)作用大于只應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的情況.

    A:D/F20S培養(yǎng)基與ACM培養(yǎng)大腦皮層單細(xì)胞獲得OPCs的代表性圖片;B:兩組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

    3 討論

    星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種獨(dú)特的細(xì)胞類型,對少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系中的其他細(xì)胞類型具有關(guān)鍵作用,可以直接影響少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞的存活和產(chǎn)生[16].星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過分泌生長因子支持OPCs的生長[4],因此,用小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞制備ACM,能使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的各種生長因子擴(kuò)散于ACM中,當(dāng)用ACM來培養(yǎng)小鼠大腦皮層細(xì)胞時(shí),有利于從這些單細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生OPCs,這跟理論預(yù)期相符合.有研究顯示,小鼠的OPCs對消化酶比較敏感,導(dǎo)致很多OPCs在組織消化過程中遭受酶的消化損傷而死亡[7].本研究發(fā)現(xiàn)ACM有利于小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)獲得OPCs,據(jù)此推測ACM可能提高了某些受酶損傷OPCs的存活率,從而有利于獲得更多SOX10+OPCs.大腦皮層組織塊未經(jīng)酶的消化損傷,因而有利于OPCs的存活及生長[7].但是本研究發(fā)現(xiàn)ACM也有利于皮層組織塊培養(yǎng)獲得OPCs,可見ACM促進(jìn)OPCs的制備不僅僅局限于提高細(xì)胞的存活率,可能還通過促進(jìn)OPCs分裂,甚至通過促進(jìn)其他祖細(xì)胞向OPCs分化而獲得更多的SOX10+細(xì)胞.

    星形膠質(zhì)細(xì)胞對OPCs的支持作用有兩種途徑,其中之一是星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌生長因子,擴(kuò)散于培養(yǎng)基中,即制備ACM的原理;其二是星形膠質(zhì)細(xì)胞能通過細(xì)胞之間的直接接觸而傳遞某些有用的信號,從而支持OPCs的產(chǎn)生與分裂[4].因此,本研究設(shè)置了將小鼠大腦皮層單細(xì)胞接種于小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層之上的實(shí)驗(yàn)條件,與對照組相比,飼養(yǎng)層組獲得了更多的SOX10+細(xì)胞,印證了星形膠質(zhì)細(xì)胞支持OPCs生長的第二條途徑.但是,星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對OPCs產(chǎn)生的促進(jìn)作用不如ACM,推測出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是星形膠質(zhì)細(xì)胞通過與OPCs之間的相互接觸進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的促進(jìn)作用不如其分泌的生長因子強(qiáng).鑒于ACM和小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對OPCs的產(chǎn)生均有促進(jìn)作用,且本研究證明兩種促進(jìn)因素共同存在時(shí),OPCs的產(chǎn)量多于只有一種促進(jìn)因素時(shí)的情況,因此,在制備OPCs時(shí)可以考慮將這兩個(gè)有效因素合并使用.

    4 總結(jié)

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ACM能顯著提高小鼠原代OPCs的制備效率,與星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層相搭配甚至可以進(jìn)一步提高OPCs的產(chǎn)量.這一方法有望獲得足夠數(shù)目的OPCs用于少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育或者脫髓鞘治病機(jī)理的研究.

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