鐵死亡與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展*

黃 健， 安紅偉， 曹詩杰

（1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西柳州545001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）常表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙與行為損害，也是癡呆最常見的病因，目前全世界約有5 000 萬患者。AD 的病理特征是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成細(xì)胞外老年斑（senile plaques，SPs）和高磷酸化tau 蛋白形成細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。此外，AD 患者神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，伴有氧化應(yīng)激和鐵超載。Dixon 等［1］于 2012 年首次報道鐵死亡（ferroptosis）是一種以細(xì)胞內(nèi)鐵沉積為特征的細(xì)胞死亡形式。鐵沉積誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，Lipid-OOH）的積累［2］。已有研究觀察到AD 患者腦細(xì)胞表現(xiàn)出類似鐵死亡的生化和形態(tài)學(xué)特征，包括谷胱甘肽（glutathione，GSH）降解、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活、鐵代謝失衡導(dǎo)致ROS 增加、脂質(zhì)過氧化及線粒體異常［3］，并且鐵代謝紊亂與Aβ、SPs 和NFTs密切相關(guān)。本文擬對鐵死亡在AD 中的作用及機制進(jìn)行綜述。

1 腦細(xì)胞的鐵代謝

1.1 腦細(xì)胞的鐵轉(zhuǎn)運機制

1.1.1 鐵流入分子機制 細(xì)胞轉(zhuǎn)運鐵的方式有轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）和非轉(zhuǎn)鐵蛋白兩種。生理條件下Fe3+通過管腔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）與Tf 介導(dǎo)內(nèi)吞作用而被轉(zhuǎn)入細(xì)胞。盡管Tf 與鐵連接的飽和度通常為30%［4］，但疾病導(dǎo)致組織細(xì)胞鐵超載，Tf 與鐵連接飽和，多余的血漿鐵以非Tf鐵的形式出現(xiàn)。Fe3+被核內(nèi)體（endosome）金屬還原酶（metalloreductase）前列腺6次跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，Steap3）還原為Fe2+，然后可由二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）或鋅轉(zhuǎn)運蛋白 ZIP14（ZRT/IRT-like protein 14）協(xié)助而流入胞質(zhì)中的不穩(wěn)定鐵池（labile iron pool，LIP）［5］。

1.1.2 鐵流出分子機制 膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferropor-tin 1，F(xiàn)PN1）是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)僅有轉(zhuǎn)運鐵至胞外的蛋白［6］。在神經(jīng)元中，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）與 FPN1 連接并穩(wěn)定 FPN1 的表達(dá)水平，同時APP 被認(rèn)為是一種鐵氧化酶，可將Fe2+氧化為 Fe3+并轉(zhuǎn)出細(xì)胞［7］。鐵調(diào)素（hepcidin）主要由肝細(xì)胞合成和分泌，它與FPN1結(jié)合并觸發(fā)其內(nèi)化、泛素化和降解［8］。AD 大鼠模型和患者腦中APP水平被下調(diào)，同時皮層和海馬神經(jīng)元FPN1基因敲除導(dǎo)致類似AD的海馬萎縮和認(rèn)知功能下降［9］。

1.1.3 鐵在腦細(xì)胞的吸收 不同的細(xì)胞類型有不同的鐵吸收方式，神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞可通過Tf/TfR1 途徑獲取鐵，或通過DMT1 依賴的管腔途徑吸收非 Tf 結(jié)合鐵（non-transferrin-bound iron，NTBI）［10］。最近的研究表明，H-鐵蛋白（H-ferritin）與H-鐵蛋白受體的結(jié)合可能是少突膠質(zhì)細(xì)胞鐵攝取的主要來源［11］。除了 Tf/TfR1 或 DMT1 通路外，星形膠質(zhì)細(xì)胞還可能通過其末端足突吸收鐵［12］。鐵經(jīng)上述不同方式通過血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）被神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞吸收。

1.2 腦細(xì)胞鐵代謝調(diào)節(jié)機制 腦細(xì)胞鐵代謝失衡——鐵超載或鐵儲備不足與AD 有關(guān)。鐵蛋白與FPN 協(xié)同工作，在鐵氧化酶（ferroxidase）和銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin）幫助下調(diào)節(jié)LIP。LIP 調(diào)控鐵調(diào)節(jié)蛋白1（iron regulatory protein 1，IRP1）和IRP2 的激活，而IRP1和IRP2又與mRNA 鐵調(diào)節(jié)序列［稱為鐵反應(yīng)元件（iron response elements，IREs）］結(jié)合。不穩(wěn)定鐵以Fe3+復(fù)合物的形式儲存在鐵蛋白中，并通過溶酶體（lysosome）或自噬體（autophagosome）降解釋放。LIP內(nèi)增加的鐵導(dǎo)致鐵超載，激活Fenton 和Haber-Weiss反應(yīng)，從而產(chǎn)生自由基，損傷蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。通過Fenton反應(yīng)，F(xiàn)e2+被H2O2氧化為Fe3+，形成高活性的羥基自由基（·OH）；通過Haber-Weiss 反應(yīng)，超氧化物歧化作用將Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+，產(chǎn)生超氧自由基（·O2-），誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［13］。AD 患者腦內(nèi)鐵蛋白重鏈和輕鏈表達(dá)增加，提示 LIP 擴增［14］。Ayton 等［15］對 209 例 AD患者連續(xù)12 年隨訪研究的結(jié)果顯示，顳下皮質(zhì)鐵含量升高，提示鐵與認(rèn)知能力下降密切聯(lián)系。鐵代謝失調(diào)與AD 病理改變密切相關(guān)，腦鐵水平與AD 病程進(jìn)展和認(rèn)知下降呈正相關(guān)［16］。見圖1。

Figure 1. The mechanism of iron metabolism. The black arrow represents the molecular mechanism of iron transport. The blue arrow represents the regulation mechanism of iron metabolism homeostasis. The purple arrow represents the process of oxidative stress.圖1 鐵代謝的機制

2 鐵死亡

2.1 鐵死亡簡介 鐵死亡是由于鐵代謝失衡，ROS堆積導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化進(jìn)而損傷細(xì)胞，GSH 減少和GPX4 失活常誘導(dǎo)鐵死亡。電子顯微鏡下鐵死亡細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體變小、線粒體膜皺褶、線粒體嵴減少和外膜破裂，而線粒體在其他形式的細(xì)胞死亡中通常表現(xiàn)腫脹。ferrostatin-1、liproxstatin-1 和維生素E抵抗鐵死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但上述抑制劑不能抑制其他形式的細(xì)胞死亡。在鐵死亡中，鐵蛋白的自噬即鐵自噬（ferritinophagy）使得LIP 的增加，導(dǎo)致Lipid-OOH 積累和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）氧化。通過Ras 選擇性致死小分子 3（Ras-selective lethal small molecule 3，RSL3）抑制GPX4，或敲除GPX4基因可誘導(dǎo)鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）通過清除GPX4 介導(dǎo)的NAD（P）H 還原輔酶Q10，抑制脂質(zhì)過氧化，從而發(fā)揮抗鐵死亡作用。

2.2 鐵代謝參與鐵死亡 鐵代謝平衡依賴多種鐵代謝相關(guān)蛋白的協(xié)同作用，鐵代謝紊亂可能引發(fā)鐵死亡。Tf/TfR1 通路主要負(fù)責(zé)細(xì)胞吸收鐵，當(dāng)Tf/TfR1通路轉(zhuǎn)運鐵功能異常會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞鐵死亡。TfR1循環(huán)和棕櫚酰化異?？蓪?dǎo)致腦鐵沉積神經(jīng)變性病變［17］。研究表明作為吸收鐵的蛋白DMT1 過表達(dá)會導(dǎo)致黑質(zhì)鐵沉積和多巴胺能神經(jīng)元死亡［18］。鐵蛋白是細(xì)胞內(nèi)由輕鏈蛋白和重鏈蛋白組成的主要存儲鐵的蛋白，以氧化還原態(tài)非活性形式儲備鐵，并防止細(xì)胞和組織受到氧化損傷。鐵蛋白異常引起的鐵代謝失衡將誘發(fā)鐵死亡［19］。鐵死亡時胞質(zhì)內(nèi)鐵蛋白會在溶酶體內(nèi)發(fā)生鐵自噬，進(jìn)一步擴大LIP，鐵自噬增強半胱氨酸缺乏誘導(dǎo)的鐵死亡。雖然細(xì)胞內(nèi)總鐵含量可能沒有變化，但LIP擴大使細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡。鐵代謝失衡導(dǎo)致鐵超載，再通過Fenton 和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生自由基，從而激活鐵死亡。

2.3 GSH/GPX4信號通路通過介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化參與鐵死亡 膜脂中的PUFAs，特別是花生四烯酸（arachidonic acid，AA），在鐵死亡時優(yōu)先被脂氧合酶（lipoxygenases，LOXs）氧化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。AA 被酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）激活，并入磷脂酰乙醇胺（和膜），而溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）對 AA 并 入 膜 磷 脂 很 重 要［20］。 失 活 的 ACSL4 或LPCAT3 抑制鐵死亡比抑制其他形式的細(xì)胞死亡效果要強。參與脂質(zhì)過氧化的LOXs 在其活性部位需要鐵來催化，鐵螯合劑［去鐵胺（deferoxamin）和去鐵酮（deferiprone）］通過去除LOXs 中必需的鐵來抑制鐵死亡［21］。花生四烯酸 15-脂氧合酶（arachidonate 15-lipoxygenase，ALOX15）通過促進(jìn)Lipid-OOH 的形成在erastin誘導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)揮重要作用［20］。

神經(jīng)元特異性GPX4基因敲除已被認(rèn)為會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，GPX4的硒代半胱氨酸殘基突變激活鐵死亡［22］。GPX4 將 GSH 作為底物介導(dǎo) Lipid-OOH 轉(zhuǎn)換為Lipid-OH。GSSG 在NADPH 參加的反應(yīng)中被谷胱甘肽還原酶還原為GSH。GSH 是由谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GS）連續(xù)作用合成的，其中GCL 是GSH 合成的限速步驟。半胱氨酸通過半胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體（system XC-）交換谷氨酸。通過抑制system XC-減少半胱氨酸的供應(yīng)，減弱GSH 水平，可使GPX4 失活。當(dāng)GPX4 催化的脂質(zhì)反應(yīng)不足以抑制鐵介導(dǎo)的脂質(zhì)自由基生成Lipid-OOH時，將誘發(fā)鐵死亡［23］。

3 鐵死亡在AD中的作用機制

3.1 GSH/GPX4 參與的鐵死亡在AD 中作用及機制 研究表明，海馬和額葉皮質(zhì)的GSH 水平減少與嚴(yán)重的認(rèn)知障礙有關(guān)［15］，提示GSH有可能成為AD的生物標(biāo)志物。通過口服GSH 補充劑恢復(fù)大腦中的GSH 水平效果不佳，因為GSH 會迅速水解并且血腦屏障滲透不足。同樣，L-半胱氨酸（GSH 合成的限速底物）由于廣泛代謝而不足。然而，作為L-半胱氨酸前體的N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以有效地穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，在AD 大鼠模型中NAC 調(diào)控大腦GSH 水平而發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用，使用NAC可增強細(xì)胞膜和線粒體膜的通透性，從而增加GSH 水平，抑制鐵死亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［24-25］。前腦神經(jīng)元GPX4 失活誘發(fā)海馬神經(jīng)元死亡，具有特定大腦皮層和海馬神經(jīng)元GPX4基因敲除小鼠在水迷宮試驗中表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙及海馬神經(jīng)元退行性改變；硫辛酸（thioctic acid）通過下調(diào)TfR 和上調(diào)GPX4 表達(dá)來抑制鐵死亡，從而挽救學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的神經(jīng)元［23，26］。

3.2 鐵死亡與Aβ和APP 相互作用 Aβ在將Fe3+還原為Fe2+時導(dǎo)致過量自由基生成并誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。APP 是 1 型跨膜糖蛋白，是產(chǎn)生 Aβ 的前體。APP 首先被α-分泌酶或β-分泌酶分解，然后被γ-分泌酶分解。生理狀態(tài)下α-分泌酶首先切割A(yù)PP進(jìn)行非淀粉樣變途徑。然而，若APP 首先被β-分泌酶切割會產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的Aβ。而furin 蛋白在介導(dǎo)α-分泌酶或β-分泌酶的蛋白水解激活率方面起著關(guān)鍵作用，furin蛋白的濃度與α-分泌酶活性呈正相關(guān)，與β-分泌酶活性呈負(fù)相關(guān)。鐵超載導(dǎo)致furin轉(zhuǎn)錄翻譯減少。鐵通過抑制furin 蛋白表達(dá)增強β-分泌酶活性，從而使通過淀粉樣變途徑產(chǎn)生的Aβ 增加［27］。已有研究證實，受損APP 的N-糖基化或磷酸化阻礙APP向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運，從而干擾FPN1 的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞膜FPN1 的水平，鐵轉(zhuǎn)運能力顯著降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵超載，從而誘導(dǎo)鐵死亡［28］。輕度認(rèn)知障礙伴多發(fā)Aβ 斑塊的患者皮質(zhì)鐵含量較高，從而增加AD風(fēng)險。

3.3 鐵死亡與tau 蛋白和NFTs 相互作用 腦鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)與tau蛋白和NFTs密切相關(guān)。生理條件下tau蛋白是一種促進(jìn)神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)蛋白，在軸突運輸和認(rèn)知功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，tau蛋白過度磷酸化聚集成NFTs。鐵可以調(diào)節(jié)tau 蛋白磷酸化并誘導(dǎo)高磷酸化tau 蛋白的聚集。研究表明，tau 蛋白通過穩(wěn)定神經(jīng)元微管在鐵轉(zhuǎn)運中起重要作用，在正常生理學(xué)中，tau 蛋白可以通過轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜來調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵外流，tau 蛋白的過度磷酸化和聚集還可能影響鐵外流，導(dǎo)致神經(jīng)元鐵沉積和加重NFTs，引起惡性循環(huán)［29］。此外鐵沉積與神經(jīng)退行性變區(qū)域NFTs存在共定位現(xiàn)象［30］。

4 調(diào)控鐵死亡對AD的作用

自由基清除劑、鐵螯合劑和GPX4類似物等能夠抑制鐵死亡，從而防治AD。研究表明去鐵酮和NAC聯(lián)合治療AD 比單一治療更能對抗鐵誘導(dǎo)的毒性損傷，從而保護(hù)神經(jīng)，包括恢復(fù)樹突棘密度和線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)［31］。

4.1 調(diào)控鐵死亡中GPX4對AD的作用 GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵因子。RSL3、ML-162 和ML-210 與GPX4結(jié)合而抑制鐵死亡，F(xiàn)IN56 則通過抑制GPX4 活性而誘導(dǎo)鐵死亡。研究者在HT22 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)RSL3抑制GPX4活性，導(dǎo)致線粒體損傷和脂質(zhì)過氧化。α-生育酚、脂氧合酶抑制劑或沉默凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）能夠阻止GPX4 失活。Ebselen 是一種脂溶性抗氧化劑，具有類似GPX 活性。Ebselen 處理后AD 模型小鼠的空間和記憶功能明顯改善，Aβ、p-tau 蛋白和突觸后密度蛋白水平降低，并且海馬神經(jīng)元死亡減少［32］。AD 模型中海馬、顳葉和皮層區(qū)域硒含量降低，與氧化應(yīng)激增強一致。硒被神經(jīng)元用來合成作為硒代半胱氨酸載體的GPX4。AD 患者血液鐵離子水平升高與硒含量下降和認(rèn)知障礙相關(guān)，提示補充硒是一種潛在干預(yù)鐵死亡和神經(jīng)退行性變方法［33］。

4.2 自由基清除劑調(diào)控鐵死亡對AD 的作用 過量的游離鐵（Fe3+/Fe2+）因具有氧化還原性能產(chǎn)生大量自由基而激發(fā)脂質(zhì)過氧化。自由基清除劑（如ferrostatin-1和liproxstatin-1）干擾脂質(zhì)自由基氧化。ferrostatin-1是一種通過阻斷ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化的鐵死亡抑制劑，并且能抑制谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠腦細(xì)胞死亡。ferrostatin-1 和liproxstatin-1 還能抑制erastin誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡［34］。維生素E 可以被認(rèn)為是鐵死亡的抑制因素，AD 患者血漿、血清和腦脊液中的維生素E 減少，補充維生素E 可延緩輕度至中度AD 患者的功能下降［35］。維生素E 中和氧自由基，從而終止脂質(zhì)（特別是PUFAs）的過氧化。中年人長期補充PUFAs 可保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化，降低癥狀前期的AD 風(fēng)險［36］。給予大鼠高維生素E 飲食或給予鐵死亡抑制劑liproxstatin-1時，神經(jīng)元退行性改變水平降低［37］。

4.3 鐵離子螯合劑調(diào)控鐵死亡對AD 的作用 鐵螯合劑可抑制鐵死亡，從而恢復(fù)細(xì)胞功能。低親和力鐵螯合劑調(diào)控鐵代謝紊亂，抑制細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而治療AD。去鐵胺可減輕AD 患者的認(rèn)知能力下降，然而，由于缺乏去鐵胺穿透BBB 的研究，去鐵胺治療沒有進(jìn)一步研究。鐵螯合作用減弱氧化應(yīng)激，降低Aβ水平和tau 蛋白過度磷酸化?；颊呓邮荑F螯合劑治療最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是中性粒細(xì)胞減少（8.5%）［38］，因此定期評估鐵代謝的主要器官肝腎的功能至關(guān)重要。

4.4 system XC-抑制劑調(diào)控鐵死亡對AD的作用 抑制system XC-使細(xì)胞缺乏半胱氨酸，從而使GSH 水平降低，GPX4 失活。半胱氨酸供應(yīng)可被system X-抑

C制劑［包括erastin、柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine）和索拉非尼（sorafenib）］阻斷。erastin 通過ALOX15 促進(jìn)Lipid-OOH 的形成，從而誘導(dǎo)鐵死亡［20］。而激活system XC-使谷氨酸轉(zhuǎn)出增加，可激活抑制性代謝型谷氨酸受體，從而減輕丘腦皮層由谷氨酸過多引起的認(rèn)知損害，這種保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞鐵死亡有關(guān)［39］。

鐵死亡與AD的關(guān)系總結(jié)見圖2。

5 總結(jié)與展望

AD 患者腦細(xì)胞中鐵超載引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，加重毒性 Aβ 和過度磷酸化 tau 蛋白聚集［40］。Huang等［41］的研究顯示，Aβ 使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激或誘導(dǎo)鐵死亡，但是Aβ 與鐵死亡關(guān)系仍需深入研究。鐵死亡中脂質(zhì)過氧化與氧化應(yīng)激關(guān)系密切并且研究較多，但鐵死亡與其他形式的細(xì)胞死亡諸如自噬、凋亡和脹亡之間的關(guān)系需要更深入研究。目前討論鐵主要集中在LIP，但體內(nèi)95%的功能性鐵是血紅素，因此，需要進(jìn)一步的研究來驗證血紅素的鐵在AD 中的作用。Gleason 等［42］的研究提示，AD 病變區(qū)域鐵超載可能是認(rèn)知能力迅速下降的危險因素。當(dāng)前許多旨在單純降低Aβ 或tau 蛋白來治療AD 的臨床試驗沒有成功，可能是部分AD患者表現(xiàn)出α-突觸核蛋白和TDP43 改 變。 2021 年 6 月美 國 FDA 加 速批 準(zhǔn) 針對Aβ 的創(chuàng)新藥Aducanumab 上市引起爭議。因此，需要深入探討鐵死亡在AD 中的作用及機制，以期為AD患者提供治療新靶點。

Figure 2. The relationship between ferroptosis and Alzheimer disease（AD）. The red arrow represents the changes in the key factors of ferroptosis in AD. The black arrow represents the mechanism of GSH/GPX4 pathway in ferroptosis. The cyan arrow represents the molecular mechanism of lipid peroxidation. The blue arrow represents the activation/inhibition mechanism of ferroptosis.圖2 鐵死亡與阿爾茨海默病的關(guān)系