外泌體在腎臟疾病中的研究進(jìn)展

何星，王富博，葉華茂

外泌體是一種大小為40～160 nm的細(xì)胞外囊泡，包含有多種諸如核酸、蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸、小分子代謝物等內(nèi)容物，這些內(nèi)容物可以反映其細(xì)胞來源。此外，外泌體還可以將內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞，成為細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞的重要媒介。外泌體在體液中廣泛存在。有研究通過分析腎單位不同節(jié)段的外泌體成分及其與腎臟生理和病理生理的相關(guān)性，驗(yàn)證了與腎臟疾病相關(guān)的來自血清、腎小管細(xì)胞、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、泌尿系統(tǒng)干細(xì)胞、癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的外泌體的來源與作用[1-2]，說明外泌體廣泛參與了多種腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。本文就外泌體在腎臟生理學(xué)和腎臟疾病的分子機(jī)制、診斷和治療中的作用等方面進(jìn)行綜述。

1 外泌體在腎臟生理學(xué)中的作用

腎臟是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要器官之一。外泌體在腎單位細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，腎單位中的外泌體主要來自位于近曲小管、髓攀升支粗段、遠(yuǎn)曲小管和集合管的腎小球足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞。不僅如此，尿液外泌體中富含的多種蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均來自于腎單位中的細(xì)胞。例如，來自腎小球足細(xì)胞的足糖萼蛋白、來自近曲小管的水通道蛋白(aquaporin，AQP)-1、來自髓袢升支粗段的2型Na+-K+-2Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體、來自遠(yuǎn)曲小管的Na+-Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體以及來自集合管的AQP-2蛋白[3]。這些研究表明，腎單位中的外泌體來源于腎單位中的不同細(xì)胞，而且包含有這些細(xì)胞中的重要信息分子。

研究發(fā)現(xiàn)，集合管細(xì)胞在血管加壓素類似物作用下，其外泌體中AQP-2表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞上調(diào)AQP-2的表達(dá)以增強(qiáng)水的重吸收[4]。Gildea等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細(xì)胞的外泌體可沿近曲小管將信息傳遞至遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞。用非諾多泮(多巴胺受體激動(dòng)劑)處理近曲小管細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體可以轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)曲小管和集合管，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)該部位細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。因此，在腎臟生理中，外泌體作為細(xì)胞間傳遞信息的媒介，可以將生物活性分子從近端腎小管細(xì)胞傳遞到遠(yuǎn)端小管細(xì)胞并發(fā)揮激活效應(yīng)細(xì)胞的作用。

2 外泌體與腎臟疾病

外泌體在腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，對(duì)于外泌體的研究不僅能夠進(jìn)一步闡述腎臟疾病的分子機(jī)制，還能為腎臟疾病的分子診斷、預(yù)后判斷和治療提供新的思路和方法。

2.1 外泌體在急性腎臟損傷中的研究進(jìn)展 急性腎臟損傷機(jī)體的尿液外泌體中含有相關(guān)致病分子、生物標(biāo)志物和治療因子。對(duì)急性腎臟損傷致病機(jī)理和生物標(biāo)志物的研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎臟損傷可降低大鼠尿液外泌體中AQP-1、AQP-2的mRNA表達(dá)水平。AQP表達(dá)水平的降低可能會(huì)影響腎單位中水的重吸收，并與急性腎臟損傷的病程進(jìn)展相關(guān)[6]。另外，大鼠的尿液外泌體miRNAs可用于判斷缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎臟損傷的病程進(jìn)展。該研究發(fā)現(xiàn)，在早期損傷階段可檢測(cè)到外泌體miR-16、miR-24和miR-200c水平升高，而在晚期纖維化階段則發(fā)現(xiàn)miR-125和miR-351水平升高[7]。Sonoda等[8]發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎臟損傷小鼠模型的尿液外泌體中胎球蛋白A水平升高，但AQP-2水平降低。這些研究表明，尿液外泌體中相關(guān)信號(hào)分子可用于急性腎臟損傷的分子診斷和預(yù)后判斷。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體具有治療效果，能夠減輕急性腎臟損傷的病變程度。通過給予人臍帶Wharton′s jelly來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可減輕大鼠缺血再灌注引起的急性腎損傷并改善腎功能[9]。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體C-C模體趨化因子受體2(C-C motif chemokine receptor-2，CCR2)含量增高并能夠降低其配體——CCL2的水平，從而抑制后者在小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎臟損傷中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的作用[10]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體富含miR-199a-3p，可以通過增加miR-199a-3p在腎細(xì)胞中的表達(dá)水平從而預(yù)防缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎臟損傷。此外，向大鼠靜脈注射腎小管細(xì)胞外泌體可以改善局部缺血誘導(dǎo)的腎損傷[11]。這些研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞或腎臟細(xì)胞來源的外泌體可能改善腎損傷的預(yù)后，這為急性腎損傷的預(yù)防和治療提供了新的方法。

2.2 外泌體在腎移植排斥反應(yīng)中的研究進(jìn)展 目前，腎臟活檢是診斷腎移植排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這種有創(chuàng)診斷技術(shù)常常會(huì)造成血尿等諸多活檢相關(guān)并發(fā)癥。外泌體中潛在的生物標(biāo)志物或可更便捷地診斷細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的同種異體移植反應(yīng)。T細(xì)胞浸潤(rùn)是診斷腎移植后急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的標(biāo)志之一。發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的患者尿液的外泌體中檢測(cè)到CD3強(qiáng)陽(yáng)性，這可能提示腎同種異體移植中T細(xì)胞的浸潤(rùn)[12]。對(duì)于抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，在同種異體移植排斥反應(yīng)患者的血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)、CCL4、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis fact￣or，TNF-α)、含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白1B (SH2 domain containing 1B，SH2D1B)、小窩蛋白1(caveolin 1，CAV1)和非典型趨化因子受體1的mRNA水平升高[13]。

外泌體有助于揭示腎臟移植后的病理變化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，宿主在接受腎移植后出現(xiàn)蛋白尿，其尿液外泌體γ上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)的50 kDa和75kDa亞基含量升高，并與出現(xiàn)的高血壓有相關(guān)性[14]。此外，有患者腎臟移植后第1天尿液外泌體AQP-2含量下降，伴有尿量增加和尿滲透壓降低，但尿液外泌體AQP-2含量在移植后第6天恢復(fù)，這提示腎移植后AQP-2的一過性下降和腎小管水重吸收功能受損可能是導(dǎo)致移植后的急性利尿反應(yīng)的重要原因[15]。

外泌體還可用于監(jiān)測(cè)免疫抑制藥物的毒性。在使用環(huán)孢素-A的腎移植患者中發(fā)現(xiàn)尿液外泌體Na+-K+-2Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加，合并高血壓的腎臟移植患者接受他克莫司治療后，尿液外泌體Na+-Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量也出現(xiàn)升高[16]。這2種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量的升高均與高血壓相關(guān)，而高血壓是腎臟移植后免疫抑制治療期間的常見并發(fā)癥。

總體而言，外泌體含有眾多的分子標(biāo)志物與腎臟移植相關(guān)。移植后早期對(duì)外泌體的檢測(cè)可能有助于臨床醫(yī)生更好地判斷異體移植腎的功能狀態(tài)。

2.3 外泌體在腎細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展 外泌體為腎細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供重要的線索。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌患者尿液外泌體基質(zhì)金屬蛋白酶9、血漿銅藍(lán)蛋白、足糖萼蛋白、阻黑體4(dickkopf-related protein 4，DKK4)和碳酸酐酶IX增加，而AQP-1、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子、中性溶酶、二肽酶-1和多配體聚糖結(jié)合蛋白1減少[17]。Butz等[18]發(fā)現(xiàn)與正常人相比，腎透明細(xì)胞癌患者尿液外泌體miR-126-3p與miR-449a或miR-34b-5p同時(shí)升高。與腎臟良性占位病變相比，腎透明細(xì)胞癌患者尿液外泌體miR-126-3p與miR-486-5p同時(shí)升高。此外，臨床研究表明，血清外泌體miR-224和miR-210可以作為診斷腎透明細(xì)胞癌生物標(biāo)志物[19]。因此，體液外泌體有望作為一種良好的腎細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，可對(duì)患者進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)的監(jiān)測(cè)。

另外，外泌體在腎細(xì)胞癌的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要的作用。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌患者原代細(xì)胞和腎細(xì)胞癌細(xì)胞系外泌體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)β1水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致自然殺傷細(xì)胞功能障礙[20]。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)患者的腫瘤干細(xì)胞外泌體能促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，CD103陽(yáng)性的外泌體可作為轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物。腎細(xì)胞癌細(xì)胞外泌體與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素(IL)-12共同刺激的CD8+T細(xì)胞具有自體抗癌效應(yīng)[22]。

2.4 外泌體在腎臟結(jié)石病中的研究進(jìn)展 腎結(jié)石的形成不僅與尿液晶體過飽和相關(guān)，還與尿液晶體、蛋白質(zhì)、外泌體、膠原纖維和細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)。結(jié)石附著部位的腎乳頭組織在電鏡下可見許多有核磷酸鈣晶體的外泌體生長(zhǎng)。

炎癥狀態(tài)中巨噬細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的富集有助于形成結(jié)石基質(zhì)。有研究檢測(cè)了巨噬細(xì)胞在鈣鹽處理后其外泌體中蛋白組學(xué)的變化，并進(jìn)行了蛋白功能測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞外泌體中參與免疫調(diào)節(jié)(如參與T細(xì)胞活化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞遷移等)的蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)改變；ELISA結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞外泌體IL-1β(炎癥小體活化的標(biāo)志)含量增加。進(jìn)一步的功能測(cè)定結(jié)果顯示，鈣鹽處理后外泌體增加了巨噬細(xì)胞的吞噬活性。為進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)組的變化與免疫功能的關(guān)系，作者發(fā)現(xiàn)通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制波形蛋白(外泌體中含量明顯升高的一種蛋白)的表達(dá)可以消除巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)單核細(xì)胞、T細(xì)胞遷移和巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響，這進(jìn)一步證實(shí)了外泌體波形蛋白能夠參與免疫細(xì)胞募集和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)鈣處理后產(chǎn)生的外泌體中有26種蛋白質(zhì)含量發(fā)生改變，而未經(jīng)鈣處理的巨噬細(xì)胞外泌體則無此改變。這些發(fā)生改變的蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白結(jié)合、鈣結(jié)合、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞外基質(zhì)降解。進(jìn)一步的功能測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)鈣處理后產(chǎn)生的外泌體使腎小管細(xì)胞過表達(dá)IL-8并促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移。此外，巨噬細(xì)胞經(jīng)鈣處理后產(chǎn)生的外泌體更容易釋放出內(nèi)容物以激活炎癥，這些外泌體能緊密結(jié)合鈣鹽結(jié)晶，隨后在細(xì)胞外基質(zhì)不斷累積[24]。這些發(fā)現(xiàn)表明，巨噬細(xì)胞外泌體在多方面參與了腎小管細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)腎結(jié)石的形成。

2.5 外泌體在狼瘡性腎炎和其他腎小球疾病中的研究進(jìn)展 尿液外泌體檢查是一種無創(chuàng)的生物標(biāo)志物檢查方法，可以用于多種腎小球疾病的嚴(yán)重程度和疾病預(yù)后的評(píng)估。狼瘡性腎炎小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著腎小球損傷的進(jìn)行性加重，miR-26a在尿液外泌體中的含量也逐漸增加并通過調(diào)節(jié)足細(xì)胞分化而維持細(xì)胞骨架完整性。因此，其有望成為腎小球腎炎中足細(xì)胞受損的標(biāo)志物[25]。炎性miRNA(如let-7a和miR-21)在狼瘡性腎炎患者的尿液外泌體中含量降低，故可作為狼瘡性腎炎臨床分期的一項(xiàng)指標(biāo)[26]。和正常人相比，活動(dòng)性狼瘡性腎炎IV類患者尿液外泌體miR-3135b升高，而miR-654-5p僅在形成新月體的狼瘡性腎炎IV類患者中升高[27]。

此外，外泌體mRNA和miRNA也是腎小球疾病的重要檢測(cè)指標(biāo)。例如，局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥患兒尿液外泌體miR-193a含量高于腎病綜合征患兒[28]。IgA腎病患者尿液外泌體中CCL2的mRNA水平升高，并且與疾病活動(dòng)性相關(guān)[29]。此外，有報(bào)道稱特發(fā)性腎病綜合征患兒的尿液外泌體中有30種miRNAs含量明顯增加，其中miR-194-5p、miR-23b-3p含量與尿蛋白水平具有較明顯的相關(guān)性[30]。因此，通過對(duì)尿液外泌體中相關(guān)分子分析或可進(jìn)一步確定腎小球疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。

2.6 外泌體在慢性腎臟病中的研究進(jìn)展 外泌體在糖尿病腎病和腎纖維化等慢性腎臟病的疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，1型糖尿病腎病與尿液外泌體中纖溶酶、前列腺素和尿激酶的增加相關(guān)，同時(shí)也與ENaC的蛋白水解有關(guān)，這可能導(dǎo)致鈉潴留和高血壓[31]。高糖條件培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能夠促進(jìn)糖尿病腎病腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化，高血糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞外泌體的分泌，繼而引起腎小球系膜增生并激活腎組織炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，敲除TGF-β1后可以減弱該種作用，這表明TGF-β1可能是巨噬細(xì)胞與腎細(xì)胞之間相互作用的重要媒介[32]。一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究將糖尿病腎病患者與正常人的尿液外泌體進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示糖尿病腎病患者尿液外泌體雙庫(kù)尼茨抑制劑前體和組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶升高，而電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1降低，這可能有助于糖尿病腎病診斷和病情監(jiān)測(cè)。糖尿病腎病患者尿液外泌體中也檢測(cè)到AQP-2和AQP-5升高，表明這些蛋白可以作為診斷糖尿病腎病生物標(biāo)志物[33]。miRNA微陣列轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病患者和正常人對(duì)比，2型糖尿病腎病患者尿液外泌體中共檢測(cè)到16種miRNA含量異常。其中大部分miRNA僅在出現(xiàn)微量白蛋白尿的糖尿病腎病患者中能檢測(cè)到，通過qRT-PCR證明miR-320c和miR-6068與尿白蛋白排泄率具有明顯的相關(guān)性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-320c可能通過作用于血小板反應(yīng)蛋白-1而影響TGF-β信號(hào)通路，因而其有望作為2型糖尿病腎病病情監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物[34]。因此，這些指標(biāo)或可作為診斷2型糖尿病腎病的生物標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者的尿液外泌體miR-29c和miR-181a降低，并與疾病病程或腎纖維化相關(guān)[35]。Jiang等[36]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)來抑制樹突狀細(xì)胞向腎臟的浸潤(rùn)，該外泌體還能抑制腎纖維化并降低促炎細(xì)胞因子(TNF-α和TGF-β1)的水平，此外，來自泌尿系統(tǒng)干細(xì)胞的外泌體含有生長(zhǎng)因子、TGF-β1、血管生成素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7，它們可能在糖尿病腎病的早期參與血管再生和細(xì)胞增殖。這些研究表明，利用外泌體有望對(duì)糖尿病腎病和腎纖維化等慢性腎臟病進(jìn)行治療干預(yù)。

3 結(jié)論與展望

隨著研究的深入，外泌體必將會(huì)在腎臟疾病的診斷和治療方面發(fā)揮越來越重要的作用。與常規(guī)的生物標(biāo)志物相比，外泌體富含核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、代謝產(chǎn)物等特定的生物標(biāo)志物，其可從分子水平反映腎臟疾病的遺傳、代謝等病理生物學(xué)信息，有助于腎臟疾病的特異性診斷；外泌體內(nèi)生物標(biāo)志物含量及分布穩(wěn)定，測(cè)量的可重復(fù)性強(qiáng)，有助于對(duì)腎臟疾病進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)的監(jiān)測(cè)；外泌體內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)變化亦可反映腎臟疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，能夠?yàn)槟I臟疾病的預(yù)后提供良好的標(biāo)志物。雖然外泌體在疾病治療方面顯現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì)，但外泌體目前并沒有在腎臟疾病有實(shí)質(zhì)性的臨床應(yīng)用，后續(xù)仍需進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。

目前對(duì)于外泌體在腎臟疾病中的應(yīng)用也面臨著各種挑戰(zhàn)。首先，由于某些成分(例如高密度脂蛋白、乳糜微粒和微囊泡)的大小與外泌體相近，因此分離或純化外泌體仍具有挑戰(zhàn)性。其次，用于腎臟疾病“液體活檢”的外泌體，其來源復(fù)雜，如何分離和鑒定出特定疾病來源的外泌體，提高其診斷的特異性仍然是目前亟待解決的問題。最后，外泌體在各種腎臟疾病發(fā)生和發(fā)展中的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。