蘆葦屬植物的分子生物學研究進展

卓 蕾，向成麗，何昌杰，吳章橋，葉媛麗

（西南科技大學生命科學與工程學院/四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽 621010）

蘆葦（Phragmites communis）為禾本科蘆竹亞科多年生水生或濕生植物，是我國分布較為廣泛的植物資源，多生于江河湖澤、池塘溝渠沿岸等低濕地[1]。蘆葦以其迅速的繁殖能力，形成連片的蘆葦群落，是造紙和建棚的原材料。蘆葦應(yīng)用廣泛，除用作原料外，其根狀莖可供藥用[2]，也可作飼料。同時，蘆葦屬植物根莖四布，有固堤之效，豐富的通氣組織有凈化污水的作用，是植物界中集經(jīng)濟價值和生態(tài)價值于一身的典型代表，備受人們關(guān)注。

長期以來，人們對蘆葦?shù)难芯恐饕性诘乩矸植糩3]、生態(tài)型劃分[4]、形態(tài)變異[5]和生理響應(yīng)[6]等方面。近年來，隨著分子生物學技術(shù)進步，國內(nèi)外學者將分子生物學技術(shù)應(yīng)用到蘆葦研究中，取得了一些重要進展，為揭示蘆葦屬植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控機制等奠定了重要的分子基礎(chǔ)。現(xiàn)就蘆葦分子生物學方面的最新研究進展進行論述，以期為該領(lǐng)域的深入研究及開展蘆葦資源的合理利用提供參考。

1 克隆多樣性和遺傳多樣性

蘆葦克隆種指由同一個祖先通過無性繁殖形成基因型相同的所有子代組成的群體，常用克隆多樣性表示種群內(nèi)遺傳變異程度，而用遺傳多樣性表示種群間的遺傳分化程度。多樣性分析如果僅著眼于蘆葦形態(tài)特征，往往會低估形態(tài)相似群叢的多樣性，而高估由環(huán)境差異造成形態(tài)差異顯著群叢的多樣性。隨著DNA 分子標記技術(shù)應(yīng)用于蘆葦屬植物，度量種群的克隆多樣和遺傳多樣性變得更為準確可靠。

1.1 全基因組分子標記

近年來，傳統(tǒng)的分子標記（諸如RAPD、ISSR、SSR等）均在蘆葦屬植物上得到應(yīng)用，也有不少研究者結(jié)合多種分子分析標記或分子標記結(jié)合傳統(tǒng)遺傳標記綜合分析。楊曉杰等[7]利用ISSR 標記對扎龍野生蘆葦多樣性進行分析，結(jié)果顯示，ISSR 標記特異性強、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高，適用于蘆葦?shù)倪z傳分析。分析得出該地蘆葦變異程度高，變異來源主要是居群內(nèi)，說明地理位置距離近的蘆葦遺傳不一定相似。林文芳等[8]采用ISSR 與RAPD 結(jié)合的方式對河西走廊4 種不同生態(tài)型蘆葦進行綜合分析，2 種分子標記所得數(shù)據(jù)具有正相關(guān)性，因此彼此間可以相互驗證結(jié)果的可靠性。此外，結(jié)合土壤鹽分因子和水分因子分析，不同生態(tài)型之間產(chǎn)生了由水生經(jīng)鹽漬向沙丘進化的變異趨勢。綜合以上研究成果，結(jié)合蘆葦屬植物在不同生境的長期適應(yīng)中易形成不同生態(tài)型的特性可以粗略得出，環(huán)境因子對蘆葦遺傳多樣性的影響大于地理距離的影響。而得出地理距離近者遺傳相似度高這一結(jié)論有可能是因為該研究地地理位置近的區(qū)域恰好生境相似度高，從而造成了相關(guān)性因子歸納錯誤。張儷文等[9]對此做出了驗證，其利用另外一種分子標記——SSR 標記研究遺傳變異與地理距離、生境鹽度的關(guān)系，結(jié)果顯示，群體間遺傳多樣性與地理距離無關(guān)，而與生境的鹽度具有正相關(guān)。此外，Li 等[10]采用AFLP 與SSAP 分子標記對中國松嫩平原4 個不同生境蘆葦進行了遺傳變異研究，結(jié)果表明，遺傳多樣的聚類與地理聚類一致，進一步對同一克隆群體內(nèi)私有條帶同源性分析表明調(diào)控基因和反轉(zhuǎn)錄因子可能在蘆葦生態(tài)適應(yīng)和分化中起重要作用，而這一作用受到外界環(huán)境的影響。還有研究者進一步研究環(huán)境脅迫因子是否會產(chǎn)生遺傳水平的變異，如鄧仕槐等[11]采用RAPD 標記揭示在畜禽長期高濃度污染脅迫下，蘆葦?shù)腄NA 水平發(fā)生變異。Gao 等[12]發(fā)現(xiàn)鹽堿生境鑲嵌中蘆葦自然種群表現(xiàn)出明顯遺傳變異，而從蘆葦?shù)姆敝程攸c來說，蘆葦屬植物屬于典型的無性繁殖植物，只有在種群形成初期才會進行有限的有性繁殖，理論上種群內(nèi)的遺傳變異小，但研究證明蘆葦居群具有高水平多樣性，原因可能是多種環(huán)境因子介導(dǎo)了蘆葦?shù)倪z傳分化，研究結(jié)果也表明了遺傳多樣性與生境異質(zhì)性的強烈關(guān)聯(lián)。

1.2 葉綠體基因組分子標記

葉綠體分子標記是研究蘆葦屬植物遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育的重要工具。胡思文等[13]利用葉綠體DNA rpl16 基因序列為引物擴增目標基因，對擴增產(chǎn)物進行DNA 測序和拼接，最后進行遺傳分析得出長江中下游蘆葦變異程度低于云貴高原，而兩者居群間的分化程度都較居群內(nèi)更高。此外，還基于rpl16 基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，說明不同地理區(qū)域之間的蘆葦樣品有較高分散性，可以分為2 個單系。而龔曉潔等[14]利用葉綠體matK/trnK 基因序列，構(gòu)建3 個嚴格一致的系統(tǒng)發(fā)育樹，對蘆葦進化方向提出了分子水平的證據(jù)支持，即水生蘆葦是最古老的類群，鹽漬過渡型蘆葦屬于中間過渡類群，最終向沙漠型蘆葦發(fā)展，這與林文芳[8]研究結(jié)果一致。

2 表觀遺傳學

表觀遺傳是指基因表達通過修飾發(fā)生變化而DNA 序列本身不發(fā)生改變的現(xiàn)象，包括以DNA 甲基化和組蛋白修飾影響基因轉(zhuǎn)錄和以RNA 修飾影響翻譯2 種。此現(xiàn)象受到外界條件的調(diào)控，并在生物體眾多重要的生命過程中起關(guān)鍵作用。研究蘆葦屬植物受多種環(huán)境脅迫后的表觀遺傳反應(yīng)，有利于對該屬植物在污染環(huán)境下的正常生長、生存及生產(chǎn)能力作出判斷，以期更好開發(fā)其治理污染的能力。目前對蘆葦屬植物的表觀遺傳學研究仍處于起步階段，主要集中在利用DNA 甲基化修飾對遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。石奔[15]采用DNA 甲基化敏感多態(tài)性技術(shù)研究中國嫩江平原上蘆葦多樣性，該研究證實了MSAP 技術(shù)適用于蘆葦植物，并且從DNA 甲基化水平分析得出該地蘆葦由環(huán)境差異導(dǎo)致的遺傳變異程度高，其中除土壤鹽堿度參與蘆葦種群間的表觀遺傳分化外，還有其他環(huán)境因素對其產(chǎn)生影響。邱天[16]借助相同的方法研究2種生境下的蘆葦，結(jié)果表明，蘆葦存在廣泛的DNA 甲基化，甲基化敏感位點中多態(tài)位點所占的百分比較高，基于此分析得出生境間表觀遺傳分化達到了極顯著水平（P＜0.01）。Spens 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，引入亞種和天然亞種之間的表觀遺傳特征有顯著差異，并且發(fā)現(xiàn)引入亞種比天然亞種表現(xiàn)出更多的表觀遺傳變異，這給引入的亞種帶來競爭優(yōu)勢。

3 功能基因研究

研究蘆葦屬植物功能基因是揭示蘆葦屬植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控機制的重要途徑。目前，蘆葦屬植物功能基因的研究主要集中在抗逆基因、金屬脫毒相關(guān)基因等。

3.1 基因文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組分析

獲得高質(zhì)量的高分子量核DNA（HMW-DNA）是構(gòu)建基因文庫的前提。楊俊等[18]基于前人的研究，對Zhang 等[19]的傳統(tǒng)方法進行改進，諸如在研磨時在細胞核提取液中加入4%PVP-40、2%PPVP 以避免多酚類物質(zhì)氧化，為更有效去除細胞器對DNA 的干擾，將緩沖液中TritonX-100 濃度由0.5%增加到0.75%的改良。結(jié)果獲取的HMW-DNA 經(jīng)酶得到的DNA 片段完全符合構(gòu)建BIBAC 文庫所需的條件。此研究為耐鹽蘆葦?shù)拇笃蜠NA 遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，為轉(zhuǎn)基因獲得耐鹽作物提供了新的思路。高鴻等[20]利用楊俊的方法，構(gòu)建耐鹽蘆葦不同大小的片段DNA-BIBAC 載體，經(jīng)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)，成功轉(zhuǎn)化了粳稻成熟胚愈傷組織，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽水稻植株。經(jīng)實驗總結(jié)得出，插入的DNA 片段越大轉(zhuǎn)化效率越低。此外，肇瑩等[21]首次利用SSH 技術(shù)對通過花粉管轉(zhuǎn)導(dǎo)蘆葦總DNA 的變異水稻構(gòu)建cDNA 文庫。結(jié)果表明所構(gòu)建的文庫質(zhì)量良好，通過RT-PCR 技術(shù)進一步驗證了蘆葦總DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)到水稻中，能使水稻獲得了抗鹽性。綜上，盡管利用基因工程技術(shù)將特定外源基因?qū)胱魑锖?，一定程度上提高了作物的耐鹽能力，但耐鹽性是受多數(shù)數(shù)量性狀基因控制的復(fù)雜性狀，單個基因片段的轉(zhuǎn)化對提高作物耐鹽性作用有限。因此，只有同時轉(zhuǎn)化多個耐鹽基因，或?qū)⒛望}植物總DNA 轉(zhuǎn)入作物中，才能大幅提高作物耐鹽性。

3.2 功能基因克隆及鑒定

傳統(tǒng)的植物修復(fù)策略通常是在被污染環(huán)境中尋找超富集植物，但這樣耗時耗力，且尋找到的修復(fù)植物生物量小、修復(fù)能力弱、生長周期長、修復(fù)成本高，具有一定的局限性。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重金屬富集相關(guān)基因轉(zhuǎn)入高生物量植物，通過異源表達產(chǎn)物可介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因高生物量植物積累重金屬。植物絡(luò)合素基因合成的多肽，能鰲合重金屬，讓植物具有富集金屬能力而不致植物自身死亡。趙翠珠[22]采用RACE-PCR 技術(shù)，從蘆葦中分離了植物絡(luò)合素基因，并構(gòu)建了表達載體轉(zhuǎn)入Cd敏感型酵母菌株中。在100μM CdCl2脅迫下，試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因酵母生長情況好于非轉(zhuǎn)基因，說明過量表達植物絡(luò)合素合酶提高了酵母細胞對Cd 的抗性。隨后研究者又分別構(gòu)建載體，嘗試轉(zhuǎn)化高生物量的優(yōu)良草坪草剪股穎和高羊茅，為進一步大規(guī)模修復(fù)重金屬污染土壤奠定了基礎(chǔ)。此外，植物具有較強的抗逆性，能在被污染的環(huán)境中生存是植物修復(fù)的前提，研究者們也對蘆葦抗逆基因進行了研究。如Takahashi 等[23]從鹽敏感型和耐鹽型蘆葦植物中分別分離出鈉/氫反向轉(zhuǎn)運基因，然后轉(zhuǎn)入酵母菌進行表達，在高濃度鹽離子脅迫下，轉(zhuǎn)入耐鹽型蘆葦基因的酵母比轉(zhuǎn)入敏感型蘆葦基因酵母生長好，進一步分析得出前者酵母細胞中鈉離子含量不到后者的1/2，說明耐鹽型蘆葦鈉/氫反向轉(zhuǎn)運基因從細胞中排除鈉離子更有效，為后續(xù)的基因功能開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

4 蛋白質(zhì)組學

早在1994 年，趙相山等[24]就對沼澤蘆葦和沙丘蘆葦葉中提純的Rubisco 進行比較分析，發(fā)現(xiàn)蘆葦在長期適應(yīng)沙丘生境的過程中，發(fā)生了Rubisco 親水性氨基酸相對含量增多，SH 基含量大幅降低的適應(yīng)性變化。研究從蛋白質(zhì)分子水平闡明了沙丘蘆葦光合速率較低的本質(zhì)是Rubisco 酶活性降低，在一定程度上可以作為劃分不同生態(tài)型的遺傳依據(jù)。隨后，李衛(wèi)霞[25]利用免疫學方法分析水生、沙生蘆葦Rubisco 蛋白差異，結(jié)果表明其免疫學差異較小。林文芳[26]運用了蛋白組學技術(shù)結(jié)合生物信息學分析方法，對葉片全蛋白及葉綠體亞蛋白組進行比較分析，結(jié)果顯示，差異顯著的蛋白質(zhì)位點較多，水生和陸生蘆葦某些蛋白表達豐度差異大，且與環(huán)境呈現(xiàn)相關(guān)性。

5 展望

蘆葦是全球廣泛分布的多型種，因其廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力及強大的污染治理能力，一直以來備受人們關(guān)注。利用分子標記開展蘆葦遺傳多樣性分析研究取得了喜人的成績，為種質(zhì)資源的保護及合理利用提供了理論指導(dǎo)。蘆葦屬植物功能基因和蛋白質(zhì)組的研究起步相對較晚，研究內(nèi)容有限，后續(xù)可運用第三代測序技術(shù)結(jié)合生物信息學，大規(guī)模發(fā)掘基因資源，也可運用雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)對蛋白質(zhì)組全面分析，從而揭示蘆葦生長發(fā)育、代謝調(diào)控機制，這將促進蘆葦屬植物資源的新興利用方式的開發(fā)。