玉米孤雌生殖誘導育種法的研究進展

韓雅利，史麗麗，王 磊，史明山，范子洋，焦宏業(yè)

（邯鄲市農業(yè)科學研究院，河北邯鄲056001）

我國當前玉米育種的方法有很多，如二環(huán)系自交選育、回交改良選育、群體構建選育、輪回選擇選育等，這些方法獲得自交系都需要很長的時間，而采用孤雌生殖誘導的方法選育自交系可使材料的純合從常規(guī)育種的5～7 a縮短到1～2 a，大幅度縮短育種時間[1]，加快育種速度，提高育種效率。玉米孤雌生殖誘導方法包括2種形式，一種是利用孤雌生殖誘導進行雜交獲得單倍體，然后對單倍體進行加倍獲得純系，即一般所說的單倍體育種[2]；另一種是利用化學藥劑處理基礎材料花絲，直接誘導出二倍體籽粒[3]。

我國玉米育種競爭激烈，基層育種單位多以雜交選育等常規(guī)方法進行自交系創(chuàng)新。由于缺乏成熟的操作參數，阻礙了孤雌生殖誘導法在育種中的廣泛應用[4]。筆者通過對玉米孤雌生殖誘導法的2種方式進行論述和比較以及具體操作參數進行分析，旨在為玉米育種工作提供參考，推進玉米育種工作的進程。

1 玉米生產及種質創(chuàng)新的重要性

玉米是當前最大的糧食、飼料作物，還是生物燃料、食品、醫(yī)藥、化工等眾多行業(yè)的原料作物。玉米基本自給是我國糧食安全的底線，因此，玉米生產穩(wěn)定是國民經濟發(fā)展的重要組成部分，也是糧食安全的首要方面。

選育新品種是推進玉米產量和品質進一步提高的最可行、最快捷的途徑。21世紀以來，黃淮海地區(qū)主推品種先后有掖單系列、冀豐58、農大108、鄭單958、先玉335等，正是代表品種的出現使玉米的產量、品質以及管理方式出現質的提高。每一次品種更新換代都伴隨著優(yōu)良自交系的創(chuàng)新，同時優(yōu)良自交系的出現也將推動新一輪次的品種誕生，育成突出骨干系是研究者對育種工作的重要貢獻。

2 玉米的育種方法及途徑

當前玉米育種主要是把自交系、地方品種、雜交種等通過雜交等手段達到創(chuàng)造新的基因組合，從而獲得新種質的過程，該過程最終要通過多代自交的方法獲得自交系，至少經過6個世代[5]。除此之外，還有孤雌誘導育種、誘變育種、分子標記輔助選擇等育種選系方法。孤雌生殖誘導進行玉米單倍體育種的方法，可以在2個世代內得到純系,提高育種效率、縮短育種年限。

2.1 利用單倍體誘導系的育種方法

單倍體技術是指通過自然發(fā)生或人工誘導獲得單倍體，然后經過自然或人工染色體加倍恢復其倍性，并在此基礎上進行選擇從而獲得所需純系的方法。1950年美國一家種子公司發(fā)現了一份能夠高頻率誘導單倍體的玉米自交系材料，并命名為Stock6，推進了單倍體的育種工作[6-7]。與傳統育種方法相比，單倍體育種技術在自交系選育上具有快速、準確、高效的特點，因而越來越受到育種家的重視[8]。我國研究者劉志增等[9]、陳紹江等[10]利用Stock6同高油群體材料雜交育成了一些高誘導率、鑒別方法簡單的誘導系，以陳紹江育成的CAU5最具代表性，并通過國家產業(yè)體系平臺在國內較大范圍發(fā)放和傳播。目前，獲得玉米單倍體的主要途徑有組織培養(yǎng)、藥劑處理、遠緣雜交誘導、孤雌生殖誘導等方法。

2.2 利用化學藥劑誘導孤雌生殖直接形成二倍體籽粒

化學藥劑誘導孤雌生殖是指利用炔苯酰草胺、二甲基亞砜、赤霉素、馬來酰肼、萘乙酸、聚乙二醇、秋水仙素等化學藥劑，在基礎材料抽絲時對花絲進行注射處理，在不受精的情況下，直接獲得加倍的籽粒，從而獲得純系[11]。常用方法是花絲尚未抽出時將雌穗套袋，待花絲完全抽出5 d后剪去頂端，利用經嚴格花粉滅活的剪刀將雌穗頂端苞葉和花絲剪平，并在頂端平面撥出一個凹形坑，再用注射器將化學試劑注射到凹形坑，每個雌穗用藥2 mL，最后套上紙袋[12]。

3 孤雌誘導育種方法的優(yōu)缺點

3.1 孤雌誘導育種方法的優(yōu)點

整體上來說，孤雌誘導育種育成自交系的時間短[13]。單倍體誘導系誘導再加倍，需要2個世代；化學藥劑直接誘導二倍體只需要1個世代，極大地提高了育種效率，加快了自交系創(chuàng)新進程和品種更新速度。

孤雌誘導育種育成的自交系純度高。孤雌誘導獲得二倍體自交系只要保證獲得的是正常的二倍體，就能保證100%的純度[14-15]。在純合上的準確率比雜交育種更為精準，雜交育種即使自交6代以上也不能保證育成的自交系是完全純合的。因此，孤雌生殖誘導也可以用于某一優(yōu)良材料的提純，提升種質質量，解決品種在生產中表現差異的棘手問題。

3.2 孤雌生殖誘導育種方法的不足

育種程序繁瑣。除常規(guī)的套袋等工作要求更加嚴格外，又增加了配制藥劑、藥劑處理、種子挑選等很多環(huán)節(jié)。工作內容和程序比常規(guī)育種增加了很多，對育種研究者有一定的不適應性[16]。

獲得的種子比例少，這是限制該技術應用的一個主要方面[17]。常規(guī)育種在選育過程中會有不斷增加的種子量，而孤雌生殖誘導獲得的材料會不斷減少，由于每一階段都僅有小比例的材料進入下一階段，以致最后獲得有價值的種子數量非常少。

所需藥劑具有一定的毒性。2種形式的孤雌生殖誘導方法都需要用到各種化學藥品[18]。例如，秋水仙素、炔苯酰草胺、馬來酰肼等，尤其秋水仙素具有較大毒性，在藥品配制、藥品處理過程中都需要采取嚴格的保護措施。

4 玉米孤雌生殖誘導技術研究

玉米孤雌生殖誘導技術尤其是化學誘導二倍體形式，在具體技術層面還不太成熟，由于各個研究在藥劑種類及濃度上都不盡相同，最佳的結果也不同，沒有形成大家公知的孤雌生殖誘導育種方法標準，研究結果存在一定的差異[19-20]。

4.1 單倍體自然加倍率極低

玉米單倍體的自然加倍是指在田間自然生長條件下，當雄穗散粉時授粉自交，有花粉但花藥不開裂時人工破壞花藥，散出花粉授粉自交[21]。自然加倍主要發(fā)生在單倍體的誘導過程中，而在單倍體生長階段的自然加倍概率很小，效率極低，一般為0.05%～1.00%[22]。為了滿足育種的需要，運用人工加倍的方法顯得尤為重要。

4.2 孤雌生殖誘導系誘導相關技術研究

4.2.1 單倍體誘導系產生率高 單倍體的誘導從1964年曼陀羅花藥培養(yǎng)獲得單倍體[23]開始迅速發(fā)展，雖受基因型、培養(yǎng)條件[24]等一系列因素的影響，導致單倍體誘導難度較大，但單倍體誘導系產生率可達到12%左右，遠遠高于單倍體自然發(fā)生率。

4.2.2 影響單倍體加倍的因素 此項技術需對各種加倍方法、影響因素、加倍機理及基因型差異開展廣泛的研究，并在此基礎上研究出高效的誘導途徑[25]。誘導率普遍較低的主要原因是加倍難度較大：一是影響加倍成功的因素，包括加倍方法、處理濃度、時間、溫度的選擇[26]，只有當所有因素同時合適才能加倍成功。如在甘肅等地春播，自然加倍率較高，有可能低溫條件下生長緩慢，有助于單倍體加倍概率增加；在海南冬季種植時花粉量則較大，結實性好，誘導率高，一般可達11%左右。二是不同基因型間對加倍試劑的適應是不同的[27]，不同種間的加倍體系不具有重復性。三是加倍試劑都有不同程度的毒害作用，常使材料在處理過程中死亡。四是加倍過程中經常出現嵌合體現象，即同一植株中，只有部分分生細胞的染色體數加倍。

4.2.3 單倍體加倍藥劑的配制 常用的化學藥物有硫酸二乙酯、2，4-D、馬來酰肼（MH）、萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、秋水仙素（COL）和二甲基亞砜（DMSO）等。其中，秋水仙素效果最好，使用最廣泛，是主要的加倍試劑，但秋水仙素毒性大[28]，所以，研究者用毒性低的其他化學藥劑如氟樂靈、甲基胺草磷、炔苯酰草胺等誘導，輔助試劑一般用2%二甲基亞砜[29-30]，也有較好的加倍率。

4.2.4 加倍處理方式及效果 加倍處理方式有浸種法、浸根法、浸芽法、滴心葉法、注射法等，處理效果各個研究者結果不一[31-33]。浸種、浸芽法均比較繁瑣，工作量大，需要育苗移栽，且需要較長時間接觸有毒的化學藥劑，大規(guī)模開展需要耗費太多人力物力。

浸種法：該方法是最簡單的加倍方法，即用秋水仙素溶液浸泡萌動的單倍體種子。先將單倍體種子用清水浸泡20～24 h，種子吸脹后，用秋水仙素溶液浸泡8～12 h，再用清水浸泡1～2 h后再播種[34]，以減少對種子的傷害。采用0.06%秋水仙素浸泡胚芽切口的單倍體種子，浸泡處理12 h單倍體加倍率最高，為17.01%[35]。

浸根法：該方法主要是用秋水仙素溶液浸泡單倍體幼苗根。將2～3葉期單倍體幼苗的根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24 h，清水沖洗處理后，移栽于生長發(fā)育條件良好的環(huán)境下[36]。BORDES等[37]用該方法處理3葉期幼苗的根尖3 h，散粉率達到了30%～60%。該方法加倍效果較好，但需要的藥劑量大，成本較高。

浸芽法：當單倍體籽粒發(fā)芽到2 cm左右時，用刀片削掉幼芽頂端的胚芽鞘，在黑暗溫度18℃下浸泡12 h，然后用清水清洗后播種。ZABIROVA等[38]在18℃、黑暗條件下用0.06%秋水仙素溶液處理胚芽鞘12 h，18℃、26℃恢復2 d，加倍率分別為28.8%和31.5%。EDER等[39]利用該方法處理單倍體，49.4%的單倍體產生了可育花粉，其中，39.0%的單倍體能夠自交，27.3%的單倍體自交后結實。

滴心葉法：在單倍體3～5葉時，用0.5 mg秋水仙素滴至玉米心葉處[35]，該方法簡便易行，加倍效率為散粉率28.9%，結實率11.1%。

注射法：有2種處理方法：第1種為在田間用秋水仙素溶液注射6葉期單倍體的盾片節(jié)；第2種為在室內用秋水仙素溶液注射3～4葉期單倍體幼苗的生長點。CHASE[40]用0.05%秋水仙素和10%甘油的水溶液0.5 mL注射6葉期玉米幼苗的盾片節(jié)，結實率較對照提高了3倍以上。DEIMLING等[41]用0.125%秋水仙素溶液注射3～4葉期幼苗莖尖生長點，然后在18℃、黑暗條件下保持2 d，加倍率為27.5%。

4.3 化學藥劑誘導孤雌生殖相關技術研究

4.3.1 處理藥劑及濃度 用做孤雌誘導的化學藥劑[42]主要有炔苯酰草胺、秋水仙素、氟樂靈等，濃度一般為40～90 μmol/L，二甲基亞砜濃度為2%。

4.3.2 處理時期 多數認為，化學藥劑誘導在抽絲后3～5 d處理花絲效果最佳，也有試驗稱在抽絲前處理效果最佳[43]。

4.3.3 處理方式 主要有噴灑法和注射法。噴灑法是在適宜時期，用經花粉嚴格滅活的剪刀將雌穗頂端苞葉剪平，并在頂端撥出凹坑，將2 mL藥液灑入；注射法則是在適宜時期用注射器將2 mL藥液注入雌穗和苞葉的縫隙中。

4.3.4 處理效果 早期研究的相關結果差異非常大。趙佐宇等[3]用2%DMSO和40 mg/L MH藥劑組合進行花絲處理，誘導率為0.47%；而余建華等[44]用2% DMSO、50 mg/L MH和5 000 mg/L PEG的藥劑組合處理抽絲后5 d的花絲，誘導率為0.526%。趙念力等[45]以秋水仙素、馬來酰肼等組合藥劑處理果穗，籽粒誘導率最高為0.176%。任燕靜等[46]以氟樂靈和炔苯酰草胺處理花絲，結實株率分別達到24.03%和36.36%。

5 展望

我國玉米育種競爭激烈，基層育種單位多以雜交選育等常規(guī)方法進行自交系創(chuàng)新。由于玉米孤雌生殖誘導育種方法缺乏成熟的操作參數，操作復雜性、周期長、受環(huán)境影響較大等特性，目前2種形式的處理方法都沒有成熟的操作規(guī)程見報道，缺乏對2種方法的系統比較，阻礙了孤雌誘導在育種上的推廣和應用[47-50]。

現階段，研究者在不同單一藥劑、藥劑組合、藥劑濃度、處理時期、處理方法上進行試驗，在單倍體誘導系育種和化學藥劑直接誘導二倍體育種的方法上都取得了成功的經驗和數據。2種方法中，第1種利用單倍體誘導法在現實研究中居多，使育種周期縮短到2代，第2種利用化學藥劑直接誘導二倍體純系時間更短，一般1代就可以得到純合的二倍體種子，極大地加速了育種進程，加快優(yōu)良品種的選育進度[51-55]。

這都表明孤雌生殖誘導育種在實踐中是可以獲得純合二倍體自交系的，這對遺傳分析具有極大的意義[56-57]。今后研究者可以更加全面系統地對孤雌生殖誘導育種進行研究，形成詳盡的操作標準，為整個育種行業(yè)做出突破。