基于動態(tài)熒光指數(shù)的草莓干旱脅迫分析

景敏，馬禎元，楊帆，張琦，丁敏，陳曼龍

(1. 陜西理工大學機械工程學院，陜西 漢中 723000； 2. 陜西省工業(yè)自動化重點實驗室，陜西 漢中 723000)

水是植物體的重要組成部分，參與了植物的蒸騰、呼吸、光合作用等生理反應(yīng)過程.水分含量影響植物的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生長發(fā)育，關(guān)系著農(nóng)產(chǎn)品效能產(chǎn)出及經(jīng)濟轉(zhuǎn)化比率.傳統(tǒng)的水分含量監(jiān)測方法大多響應(yīng)速度慢、精度低且直接接觸會破壞植株生長[1].近年來，隨著各種新型無損檢測儀器研發(fā)及光學技術(shù)的發(fā)展，熒光檢測及成像技術(shù)已經(jīng)逐漸開始大范圍應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[2-4].葉綠素熒光誘導技術(shù)主要分為主動和被動2種方法，作為最大的被動遙感輻射源，基于日光誘導的葉綠素熒光分析技術(shù)在遙感領(lǐng)域最為常見[5-7]；主動誘導熒光技術(shù)則是利用激發(fā)光源激發(fā)葉綠素分子產(chǎn)生熒光，通過信號處理和光電轉(zhuǎn)換的方法獲得熒光信息.由于這一過程與光合作用競爭，因此可以通過葉綠素熒光傳感來探測植物光化學的效率[8]及不同因素對光合作用的影響[9],相當于光合作用指示器，從而廣泛應(yīng)用于植物各類脅迫狀態(tài)的監(jiān)測和預(yù)警.

葉綠素是一種優(yōu)良的熒光發(fā)射器.熒光測定技術(shù)可以不破壞細胞，不傷害生物體，在生物學和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域常被用于分析微量元素脅迫和檢驗植物樣品.王藝斐等[10]通過測定光合色素含量、吸收光譜和葉綠素熒光參數(shù), 討論了葉片黃化和脫落的關(guān)系.楊一璐等[11]利用熒光葉片圖像對辣椒的氮含量進行了建模預(yù)測.王迎旭等[12]利用葉綠素熒光成像系統(tǒng)研究了黃瓜植株不同病害區(qū)分及早期病害監(jiān)測的可行性，證明了此方法具有良好的應(yīng)用前景.DONG等[13]利用葉綠素成像技術(shù)分析了不同等級的冷害脅迫對番茄幼苗的影響.OSRIO等[14]利用葉綠素熒光成像技術(shù)研究了Fe元素對草莓光合作用的影響；PRADHAN等[15]通過測定葉綠素a熒光參數(shù)，研究了鹽脅迫和部分水分脅迫對水稻光合性能的綜合影響.除此之外，熒光技術(shù)還廣泛應(yīng)用在遙感監(jiān)測識別[16-17]等領(lǐng)域.

傳統(tǒng)熒光誘導技術(shù)多利用熒光動力學曲線進行光化學效率及光化學淬滅系數(shù)分析[18]，其中熒光快相反應(yīng)部分在數(shù)秒內(nèi)完成,檢測儀價格昂貴且批量測量操作不便.由于植物內(nèi)部因素影響，同脅迫下植物二維空間表現(xiàn)不同，而便攜式熒光儀等商用儀器難以大面積表征葉面受迫二維反應(yīng).

文中利用葉綠素熒光成像系統(tǒng)對草莓幼苗進行葉綠素熒光成像，采集并提取葉綠素熒光圖像參數(shù)，利用圖像灰度時間序列繪制熒光淬滅曲線，建立葉綠素熒光參數(shù)、動態(tài)熒光指數(shù)與干旱脅迫天數(shù)的相關(guān)模型，以實現(xiàn)草莓幼苗干旱脅迫監(jiān)測，同時結(jié)合圖像分析均勻光照下熒光圖像受迫二維表現(xiàn)的差異性，為干旱環(huán)境對草莓的生長影響研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

供試草莓品種為“久香”草莓.選20株長勢一致且約為4片真葉的草莓幼苗進行培育，植株高度為70～100 mm.

對草莓幼苗進行離體和活體干旱脅迫試驗.離體試驗是指采集草莓幼苗離體葉片熒光圖像，觀察葉綠素熒光圖像變化及部分熒光參數(shù)與脅迫時間的相關(guān)性.在試驗時采摘表面平整且無損傷的草莓葉片，經(jīng)過20 min暗處理后進行熒光圖像采集.活體干旱脅迫試驗較為復雜，需要對草莓幼苗提前進行組別培育處理.將草莓幼苗隨機分為2組A和B，每組10株，剔除異常品種后進行分組培育.其中A組不澆水為試驗組，B組每日澆水20 mL作對照組，連續(xù)7 d每隔24 h對其進行熒光圖像采集，觀察葉綠素熒光圖像參數(shù)變化規(guī)律.

2 試驗與分析

為獲得清晰易于處理的熒光圖像，設(shè)計了如圖1所示的葉綠素熒光成像采集系統(tǒng)[19].采用大功率集成LED陣列作為激勵光源，LED通過散熱基座與恒流源相連，確保散熱及持續(xù)工作.圖像采集裝置選用維視MV-EM120/C CCD相機，鏡頭前安裝有峰值680 nm半帶寬15 nm的帶通濾光片.為避免環(huán)境光的干擾，整個試驗在暗室中進行.

圖1 熒光成像系統(tǒng)示意圖

2.1 圖像預(yù)處理

圖像預(yù)處理的主要目的是消除圖像的無關(guān)信息，增強真實信息及相關(guān)信息的可檢測性和最大限度簡化數(shù)據(jù)，從而改進后續(xù)提取處理的可靠性.由于CCD成像設(shè)備及冗余環(huán)境噪聲的影響，為了更好地分析葉片區(qū)域的圖像特征，在進行數(shù)據(jù)處理前需要對采集到的葉綠素熒光圖像進行去背景操作.文中采用最大類間方差法(OTSU)進行閾值分割然后與原圖相乘進行去背景，能有效減免干旱脅迫試驗過程中植株和設(shè)備移動及多次拍攝帶來的不可量誤差.去背景流程如圖2所示.

圖2 去背景流程圖

圖3為草莓葉片預(yù)處理圖像.從左至右依次為草莓熒光葉片原圖、OTSU法進行閾值分割處理生成二值化圖像以及去背景后熒光葉片圖像.

圖3 草莓葉片熒光圖像預(yù)處理

圖4為預(yù)處理前后的圖像灰度等級對比，圖中縱坐標PX為像素，橫坐標Gray為灰度值.可以看出，通過基于OTSU閾值分割的圖像預(yù)處理，解決了圖像背景微小灰度值問題，將葉面區(qū)域以外的灰度值置0，保留原有葉片區(qū)域圖像灰度及彩色特征，有利于后續(xù)參數(shù)提取.

圖4 預(yù)處理圖像灰度直方圖

2.2 離體葉片干旱脅迫分析

通過觀察草莓植株，葉片會在離體后不斷失水干枯.采摘長勢良好的草莓葉片，放置于載物臺上使其自然失水，分析葉片離體后自然干枯失水和葉綠素熒光圖像的變化關(guān)系，并采集自然失水脅迫狀態(tài)下0～14 h下的熒光圖像.

熒光淬滅曲線的測定一般用調(diào)制式葉綠素熒光檢測儀，對于外場條件而言，抗干擾性較強，結(jié)果較為精確，但價格昂貴.文中使用CCD熒光成像裝置進行室內(nèi)熒光獲取，并提取熒光淬滅曲線進行分析.離體葉片經(jīng)過20 min暗適應(yīng)后，預(yù)設(shè)CCD采集速率為1 s，相機曝光時間100 ms.外觸發(fā)采集主動誘導光源開啟后10 min內(nèi)的熒光圖像600張，利用圖像處理軟件批量背景預(yù)處理，并計算每幅圖像的平均像素值,分析熒光圖像時間序列，提取曲線最大值(Fm)和穩(wěn)態(tài)值(Fs)等葉綠素熒光參數(shù).

圖5為葉綠素熒光淬滅曲線，圖中縱坐標PXa為像素均值.可以看出：不同采集時刻下熒光淬滅曲線衰減速率不同，離體葉片自然失水0～8 h衰減速率快，8 h之后趨于平緩；離體葉片在自然失水的12 h內(nèi)其熒光最大值Fm和穩(wěn)態(tài)值Fs都有所下降，從最大值到穩(wěn)態(tài)之間的熒光衰減過程逐漸平緩；離體12 h后葉片體內(nèi)熒光水平最大值約等于穩(wěn)態(tài)值(Fm=Fs)，相比其他測量時間(2～10 h)有非常明顯的降低，熒光圖像在主動誘導的10 min內(nèi)無劇烈衰減.

圖5 熒光淬滅曲線

計算熒光衰減比率Rfd與干旱脅迫的天數(shù)間的相關(guān)性，其中熒光衰減比率Rfd為

Rfd=(Fm-Fs)/Fs.

(1)

以圖像中葉面區(qū)域所有像素點平均像素值作為上述動力學參數(shù)參考數(shù)值，熒光衰減比率Rfd與干旱脅迫天數(shù)的相關(guān)性分析如圖6所示.可以看出，Rfd值在離體失水的前2個記錄點(0,2 h)時成平穩(wěn)趨勢，在接下來的3個記錄點(4，6，8 h)時迅速下降，最后趨于平緩.

圖6 Rfd擬合曲線

通過擬合相關(guān)性曲線，發(fā)現(xiàn)葉片離體后的熒光衰減比Rfd值用Logistic模型擬合度最高，決定系數(shù)R2=0.98，擬合公式為

y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]，

(2)

式中各參數(shù)具體值分別為A1=2.719 6，A2=0.159 8，X0=6.187 3，P=6.288 3.

2.3 活體葉片干旱脅迫分析

對草莓幼苗進行活體干旱脅迫處理，對2組共20株草莓幼苗進行圖像采集.采集過程與離體葉片干旱脅迫圖像采集過程一致，在每次熒光圖像采集前進行暗處理.拍攝激發(fā)開始到穩(wěn)態(tài)階段的熒光圖像，并通過閾值分割提取熒光圖像信息.繪制草莓幼苗在不同干旱脅迫分組下的葉綠素熒光淬滅曲線，通過連續(xù)繪制激發(fā)光源開啟后0～10 min內(nèi)600張熒光圖像的像素均值，記錄熒光強度從激發(fā)開始達到最高值，然后逐漸衰減直至達到穩(wěn)態(tài)的過程，截取熒光強度從最大值衰減到穩(wěn)態(tài)的過程即為熒光淬滅曲線，如圖7所示.

圖7 草莓幼苗熒光淬滅曲線

圖8為試驗組A與對照組B在連續(xù)7 d干旱脅迫試驗中的熒光衰減比率Rfd值變化情況,可以看出：試驗組A在7 d內(nèi)進行持續(xù)干旱脅迫，Rfd值波動較大，但干旱脅迫天數(shù)與Rfd值之間無明顯的相關(guān)關(guān)系；對照組B在7 d內(nèi)持續(xù)澆水，Rfd值較為穩(wěn)定，在1.35上下波動.

圖8 熒光衰減比率Rfd 散點圖

動態(tài)熒光指數(shù)(DFI，dynamic fluorescence index)是指熒光淬滅曲線到最大值(Fm)與曲線任意一點(Fe)之間連線的最大距離，常被用來分析水分脅迫下植物葉面水勢變化相關(guān)關(guān)系[20]，其定義圖如圖9a所示，圖中縱坐標F為熒光強度.連續(xù)高速拍攝的熒光淬滅曲線可以看作是以時間t為自變量不斷變化的函數(shù)，其中y(t)為熒光淬滅曲線，F(xiàn)m(t0,yt0)表示熒光淬滅曲線最大值，F(xiàn)e(te,yte)表示曲線上除最大值外任一定點.

顯然，可以寫出Fm-Fe直線方程與DFI的數(shù)學表達式.Fm-Fe直線的一般方程為

(yt0-yte)t-(t0-te)y+yte(t0-te)-te(yt0-yte)=0.

(3)

DFI即為熒光淬滅曲線y(t)上的動點(ti,yi)到Fm-Fe直線距離的最大值(即熒光淬滅曲線與直線最大距離)，自變量ti取值區(qū)間為[t0,te]，DFI計算公式為

(4)

利用圖7a草莓幼苗熒光淬滅曲線，分別計算Fe(te,yte)取值熒光淬滅曲線上300～600 s時產(chǎn)生的不同DFI值與脅迫天數(shù)的相關(guān)性.結(jié)果表明，當te=550 s,即Fe為熒光淬滅曲線550 s處對應(yīng)像素均值時求得DFI值與干旱脅迫天數(shù)有較高相關(guān)性，決定系數(shù)R2=0.84，擬合圖如圖9b所示，擬合方程為

y=A0+At+Bt2，

(5)

式中各參數(shù)具體值分別為A=0.954 6，B=-0.067 2，A0=4.195 1.

圖9 動態(tài)熒光指數(shù)DFI示意圖和DFI擬合曲線

2.4 干旱脅迫二維分析

相對于真彩色熒光圖像，基于灰度變換法的偽彩色圖像轉(zhuǎn)換處理可以提高熒光圖像的可辨識度.圖10為不同分組脅迫下不同天數(shù)的熒光葉片偽彩色處理后的圖像.

圖10 不同脅迫分組7 d內(nèi)的熒光偽彩色圖像

由圖10可以看出：試驗組A長期處于干旱狀態(tài)下的草莓幼苗葉面熒光分布及范圍有明顯變化，由于光合作用與熒光現(xiàn)象處于競爭關(guān)系，葉面熒光均值增大則意味著植物光合效率的降低，在干旱脅迫的第7 d，草莓葉面葉綠素分布明顯增多，這表示葉片表面嚴重失水，光化學反應(yīng)能力下降；對照組B澆水20 mL/d維持了草莓幼苗光合作用所必需的水分及土壤濕度，其光合速率無較大變化，葉片區(qū)域的熒光分布沒有較大差異.干旱脅迫引起的葉綠素含量變化在熒光偽彩色圖像上表現(xiàn)明顯，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大面積監(jiān)測反映植物生理狀態(tài)提供了一定參考.

3 結(jié) 論

1) 通過熒光采集系統(tǒng)對不同干旱脅迫分組下的草莓幼苗進行了圖像采集，基于圖像處理算法的圖像背景預(yù)處理方法可避免多次拍攝及設(shè)備移動帶來的誤差，保留葉面區(qū)域的熒光數(shù)據(jù).熒光圖像采集系統(tǒng)通過速率設(shè)定可以實現(xiàn)部分傳統(tǒng)熒光曲線檢測功能，以時間序列采集的葉綠素熒光圖像，經(jīng)過圖像預(yù)處理，像素灰度平均，可以繪制出熒光淬滅曲線，得到部分熒光曲線參數(shù).

2) 試驗表明，離體草莓葉片自然失水可以通過熒光衰減比Rfd與脅迫天數(shù)實現(xiàn)檢測，決定系數(shù)較高.活體草莓幼苗干旱脅迫7 d內(nèi)Rfd值相比對照組變化明顯，但無相關(guān)規(guī)律.熒光淬滅曲線550 s處的熒光動態(tài)指數(shù)(DFI)與活體草莓幼苗干旱脅迫天數(shù)具有高相關(guān)性，可用作草莓幼苗干旱指示預(yù)警.

3) 結(jié)合圖像的葉綠素熒光分析方法相對傳統(tǒng)的熒光檢測方法經(jīng)濟方便，不同分組下的熒光圖像在二維方向上直觀地解釋了在干旱脅迫下植株內(nèi)部葉綠素含量變化導致的植物生理狀態(tài)變化.但成像過程極易受到環(huán)境因素干擾，熒光圖像后續(xù)處理步驟繁雜，部分作物的受脅迫反映并不一致，如何大面積的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟領(lǐng)域是需要解決的問題.