綠肥配施化肥對(duì)巖溶區(qū)水稻土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

鐘菊新，唐紅琴，李忠義*，董文斌，韋彩會(huì)，李 強(qiáng)，何鐵光*

（1 中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所/自然資源部廣西巖溶動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西桂林 541004；2 聯(lián)合國(guó)教科文組織國(guó)際巖溶研究中心, 廣西桂林 541004；3 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所, 廣西南寧 530007）

我國(guó)南方巖溶生態(tài)系統(tǒng)脆弱，面臨水土流失、生態(tài)功能衰退和環(huán)境污染等問(wèn)題[1]。石灰性水稻土作為典型巖溶土壤，具有低磷和低鉀等特性[2]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)化肥需求量較大，而過(guò)量化肥投入將會(huì)導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境逐漸惡化，需要積極尋求化肥替代品。綠肥種植作為一種高效、可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)策略，在提高土壤肥力、改善土壤質(zhì)量、防止水土流失等方面起著重要的作用[3]。研究表明，種植綠肥能有效促進(jìn)稻田土壤有機(jī)質(zhì)積累[4]，提高土壤氮素利用效率[5]，改善土壤養(yǎng)分狀況。同時(shí)，冬種綠肥在減施化肥20%～40%的條件下可保證水稻品質(zhì)和產(chǎn)量穩(wěn)定[6]?？梢?jiàn)，綠肥在促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)和提高作物產(chǎn)量中發(fā)揮著重要的作用。

研究冬種綠肥作用下的土壤微生物群落特征有助于闡釋其提升土壤肥力和作物生長(zhǎng)的內(nèi)在機(jī)制。研究表明，與單施化肥相比，綠肥配施化肥能顯著改變紅壤稻田土壤細(xì)菌多樣性，提高土壤細(xì)菌總量及固氮、溶磷等多種功能菌屬相對(duì)豐度[7-8]。長(zhǎng)期綠肥施用能促使特定功能菌屬的形成，在土壤碳、氮等元素循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，由于巖溶區(qū)石灰性水稻土養(yǎng)分有效性低，在綠肥施用條件下，土壤養(yǎng)分狀態(tài)、土壤細(xì)菌群落特征及其潛在的交互關(guān)系尚不明確。因此，以活躍在巖溶區(qū)棕色石灰性水稻土的土壤細(xì)菌為研究對(duì)象，探討綠肥作用下的土壤養(yǎng)分狀況、土壤細(xì)菌群落特征及其潛在的交互關(guān)系，以期為巖溶區(qū)綠肥替代化肥提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于廣西南寧市那桐鎮(zhèn)定典村 (23°0′41′N、107°51′21′E)，該地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.6℃，年均降水量達(dá)1300 mm，平均海拔64 m。土壤類型為典型的巖溶區(qū)棕黃色水稻土，成土母質(zhì)為白云巖風(fēng)化物。2017年試驗(yàn)開(kāi)始前耕層(0—20 cm)土壤基礎(chǔ)理化性狀為： pH 7.03、有機(jī)質(zhì) 37 g/kg、全氮 5.66 g/kg、有效氮 158 mg/kg、速效磷 11.7 mg/kg、速效鉀 86 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始于2017年10月，種植模式為綠肥–早稻–晚稻連作模式，3月份正值綠肥盛花期，將綠肥翻壓后開(kāi)始種植早稻，7月底收割早稻，8月份種植晚稻，11月收割晚稻后播種綠肥。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別為單施化肥(CK)、單種綠肥(MV)和綠肥配施化肥(MF)。供試綠肥品種為紫云英(桂紫7號(hào))，播種量為 30 kg/hm2，翻壓量為 22500 kg/hm2，單季施肥量分別為 N195 kg/hm2、P2O590 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2，肥料種類為尿素 (含 N 46.4%)、過(guò)磷酸鈣 (含 P2O518.0%)和氯化鉀 (含 K2O 60%)，其中各階段的基肥∶分蘗肥∶攻穗肥均按4∶3∶3比例施入稻田。試驗(yàn)區(qū)每個(gè)小區(qū)面積為16.5 m2，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)與小區(qū)之間用田埂分開(kāi)，采用隨機(jī)區(qū)組排列。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)土壤樣品采于2020年7月，按照5點(diǎn)采樣法對(duì)0—20 cm耕作層土壤取樣，5點(diǎn)混成一個(gè)樣品，共9個(gè)土樣，裝入自封袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。去除根系等雜物后，用四分法取10 g左右的鮮土送測(cè)序公司，進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析測(cè)定；另一部分自然風(fēng)干后進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 土壤理化性質(zhì) 土壤pH采用電位法(水∶土= 2.5∶1，質(zhì)量體積比)測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀–硫酸氧化法測(cè)定；全氮采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定；全磷采用堿熔—鉬銻抗比色法測(cè)定；堿解氮以硫酸亞鐵為還原劑，采用堿解氮擴(kuò)散法測(cè)定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀(available potassium，AK)采用乙酸銨交換—火焰光度計(jì)法測(cè)定；交換性鈣(exchangeable calcium，E-Ca2+)和交換性鎂 (exchangeable magnesium，E-Mg2+)采用乙酸銨交換—原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定。具體分析方法詳見(jiàn)魯如坤的《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[9]。

1.4.2 土壤細(xì)菌 采用特異性引物 515F (5′–GTGC CAGCMGCCGCGGTAA–3′)和 970R (5′–CCGTCAA TTCMTTTRAGTTT–3′)對(duì)土壤細(xì)菌 16S rRNA 基因的V4–V5可變區(qū)建庫(kù)測(cè)序，將構(gòu)建好的混樣文庫(kù)經(jīng)文庫(kù)質(zhì)檢，合格后使用 Illumina Novaseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用FLASH軟件對(duì)正向和反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，采用Usearch軟件去除低質(zhì)序列和嵌合體，以最低細(xì)菌樣品質(zhì)量序列67733為抽平深度，以減少不同測(cè)序深度引起的潛在偏差；利用cluster命令對(duì)97% 相似性水平的 OTU (operational taxonomic unit)代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并把代表性O(shè)TU與Silva 132核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)菌序列比對(duì)；將OTU表進(jìn)行隨機(jī)抽樣到相同的測(cè)序深度后，于QIIME軟件中計(jì)算土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)和β多樣性距離(weighted unifrac)矩陣。

利用SPSS (version 25)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，LSD (P<0.05)進(jìn)行差異比較；將相對(duì)豐度≥0.5%的OTU定義為優(yōu)勢(shì)OTU，相對(duì)豐度≥0.1%的細(xì)菌門(mén)和屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，利用Origin(version 2021)繪制土壤細(xì)菌物種分布圖；利用R Studio (version 4.0.3)進(jìn)行基于樣本 Bray-curtis 距離(OTUs水平)的主坐標(biāo)分析 (principal co-ordinates analysis，PCoA)和置換多因素方差分析(Adonis)，繪制優(yōu)勢(shì)OTU熱圖和相關(guān)性熱圖；利用Canoco軟件繪制冗余分析圖(redundancy analysis，RDA)；利用Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算OTUs (相對(duì)豐度≥0.1%)的相關(guān)性，并選取相關(guān)系數(shù)r≥0.6、P< 0.01的OTUs為數(shù)據(jù)源[10]，于 Gephi (version 9.2)中繪制土壤細(xì)菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表1可知，與CK相比，綠肥處理(MV和MF)降低了土壤pH和C/N值，但顯著增加了土壤全氮含量，其中MF處理的土壤全氮含量最高，達(dá)2.58 g/kg；不同施肥處理的土壤pH、全磷、全鉀和E-Mg2+的變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為CK>MF>MV。

表1 不同施肥措施下土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil under different fertilization

2.2 土壤細(xì)菌群落α多樣性

16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果表明，3個(gè)樣品共得到原始序列863554條，樣品含有序列條數(shù)67733～106840，以最小序列數(shù)67733為抽樣深度，抽平后的OTUs數(shù)為4430～4495 (表2)。細(xì)菌群落Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各處理間均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明單施化肥和綠肥施用并未顯著改變土壤細(xì)菌α多樣性。

表2 不同施肥措施下土壤細(xì)菌α多樣性Table 2 α-diversity of soil bacteria under different fertilization

2.3 土壤細(xì)菌群落組成與群落結(jié)構(gòu)

在3種施肥處理中，綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和匿桿菌門(mén)(Latescibacteria)為細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(圖1A)，CK、MV和MF處理的相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌門(mén)分別占總細(xì)菌門(mén)數(shù)的96.63%、95.06%和96.77%。除CK和MF處理的匿桿菌門(mén)(Latescibacteria)相對(duì)豐度顯著高于MV處理外，各處理間的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)無(wú)顯著性差異。在屬水平上，地桿菌屬(Geobacter)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、RBG-16-58-14、赭黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、小梨形菌屬(Pirellula)、厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter)為前6位優(yōu)勢(shì)菌屬(圖1B)，CK、MV和MF處理相對(duì)豐度≥0.5%的細(xì)菌屬分別占總細(xì)菌屬的15.26%、15.53%和15.33%。另外，MF處理的部分優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度＜0.5%)新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、互養(yǎng)棍狀菌屬(Syntrophorhabdus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)的相對(duì)豐度顯著高于CK (圖1C)，而脫硫酸鹽菌屬(Desulfatiglans)的相對(duì)豐度顯著低于CK，說(shuō)明綠肥配施化肥一定程度上改變了土壤細(xì)菌在屬水平上的群落組成。從整體來(lái)看，PCoA分析結(jié)果表明3種施肥處理對(duì)細(xì)菌群落產(chǎn)生影響(圖1D)，但Adonis分析(P(CK-MV)=0.7；P(CK-MF)=0.7；P(MV-MF)=0.7)結(jié)果表明，各處理間的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著性差異。綜上可知，綠肥處理并未改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，但對(duì)不同物種分類水平的細(xì)菌豐度有影響。

圖1 門(mén)水平和屬水平土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)物種豐度、優(yōu)勢(shì)屬顯著性差異及基于Bray-curtis距離的主坐標(biāo)(PCoA)群落結(jié)構(gòu)分析(門(mén)水平相對(duì)豐度<0.1%歸為other；屬水平相對(duì)豐度<0.5%歸為other)Fig. 1 Dominant species abundance map at phylum and genus level under different fertilization, significant differences in dominant genera, and principal coordinate analysis based on Bray-curtis distance (relative abundance at the phylum level <0.1% was classified as other; relative abundance at genus level <0.5% was classified as other)

2.4 土壤細(xì)菌與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

優(yōu)勢(shì)OTU熱圖的分析結(jié)果表明，不同施肥處理下的優(yōu)勢(shì)OTU有差異(圖2A)。冗余分析(RDA)結(jié)果表明，環(huán)境因子對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異解釋量為74.88%，RDA1和RDA2解釋量分別為45.44%和29.44%，土壤速效鉀、交換性鈣離子、pH和全氮是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子，其中速效鉀(F=2.6,P=0.04)對(duì)微生物群落的影響達(dá)到顯著水平(圖2B)。

圖2 優(yōu)勢(shì)OTU熱圖(A)、優(yōu)勢(shì)OTU的冗余分析(B)、優(yōu)勢(shì)OTU(C)及優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(D)與土壤理化性質(zhì)的Spearman相關(guān)性分析Fig. 2 Heat map of dominant OTU(A), redundancy analysis (RDA) of dominant OTU(B), Spearman correlation analysis of dominant OTU(C) and phyla (D) with edaphic physicochemical variables

相關(guān)分析表明，大多數(shù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)土壤速效鉀、交換性鈣離子和全氮含量的響應(yīng)較為敏感。由圖2C可知，土壤速效鉀與多數(shù)優(yōu)勢(shì)OTUs呈負(fù)相關(guān)，其中速效鉀與OTUs (11、472)呈顯著負(fù)相關(guān)；土壤全氮與OTU (472)呈顯著正相關(guān)。在門(mén)分類水平上，多數(shù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度與交換性鈣離子和全氮相關(guān)，其中Patescibacteria和Omnitrophicaeota菌門(mén)與交換性鈣離子呈顯著正相關(guān)；Chlamydiae菌門(mén)與全氮呈顯著正相關(guān)，而棒狀桿菌門(mén)(Rokubacteria)與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)(圖2D)。

2.5 土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

不同施肥處理的土壤細(xì)菌群落表現(xiàn)出不同的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模式(圖3)。CK、MV和MF處理的土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分別由156、147和160個(gè)節(jié)點(diǎn)，2409、2099和2112條極顯著正相關(guān)的邊組成，其平均度分別為30.615、28.558和26.400，模塊化指數(shù)分別為0.752，0.762和0.794。當(dāng)模塊化指數(shù)>0.4，表明共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu)[11]。

由圖3可知，CK和MV處理的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相似，MF處理的細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相對(duì)復(fù)雜，表明不同施肥處理對(duì)土壤細(xì)菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)影響較大。由表3可知，各處理的細(xì)菌類群在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中所占比例不同，變形菌門(mén)(Proteobacteria)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)所占比重最大，且MF處理的細(xì)菌類群最多。此外，地桿菌屬(Geobacter)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、RBG-16-58-14為土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中前3位優(yōu)勢(shì)菌屬，可認(rèn)為是巖溶區(qū)石灰性水稻土的土壤細(xì)菌關(guān)鍵類群。

表3 細(xì)菌門(mén)在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)所占比重(%)Table 3 The proportion of bacteria phylum in co-occurrence network

3 討論

3.1 綠肥施用對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

前人研究表明，長(zhǎng)期水稻–綠肥輪作能顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和有效氮的含量，維持土壤養(yǎng)分[12]。本研究中綠肥處理(MV和MF)顯著提高了土壤全氮含量(表1)，說(shuō)明豆科綠肥可以改善稻田氮素狀況。與CK相比，綠肥處理的土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量增幅不明顯，可能與試驗(yàn)時(shí)間短，土壤有機(jī)質(zhì)積累速度緩慢有關(guān)[13–14]。此外，在無(wú)碳源輸入的情況下，豆科綠肥可活化土壤養(yǎng)分，固定大氣氮，翻壓后增加土壤有效養(yǎng)分濃度[15]，使得C/N值降低。本研究中MF處理的土壤C/N為7.44，CK處理的土壤C/N為8.38，兩者存在顯著性差異。低碳氮比的豆科綠肥可能迅速釋放氮，導(dǎo)致土壤有機(jī)氮的礦化[16]，且較低C/N的土壤有機(jī)質(zhì)分解速率較快[17]，進(jìn)一步解釋了綠肥處理增加土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量，但增幅不顯著的現(xiàn)象。

在本研究中，土壤pH、速效磷和速效鉀含量在不同施肥處理中均表現(xiàn)為CK>MF>MV(表1)，但作用機(jī)制各不相同。本研究發(fā)現(xiàn)，綠肥處理(MV和MF)土壤pH顯著低于CK，說(shuō)明施用綠肥造成土壤pH下降，與嚴(yán)嘉慧等[8]、林葉春等[18]的研究結(jié)果一致?？赡茉蛟谟谀蛩厮?、硝化過(guò)程中產(chǎn)生硝酸根離子[19]或者綠肥腐解過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸[20]，導(dǎo)致土壤酸化。磷是植物和生物生長(zhǎng)的必需元素，缺磷會(huì)導(dǎo)致作物發(fā)育遲緩[21]，對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落也起限制作用[22]。石灰性水稻土中碳酸鈣含量高[2]，施入的磷肥會(huì)與鈣鎂結(jié)合，被固定于土壤中成為無(wú)效態(tài)磷[23]，使磷肥的有效性降低。此外，綠肥可提升土壤碳、氮養(yǎng)分，激發(fā)微生物生長(zhǎng)活性[24]，使得微生物對(duì)磷的需求增加，導(dǎo)致有效磷優(yōu)先被土壤微生物所固持[25]，這便解釋了綠肥處理的土壤有效磷含量顯著低于CK原因。而巖溶地區(qū)碳酸鹽巖鉀含量低，綠肥生長(zhǎng)需吸收大量鉀素[26-27]，因此綠肥處理降低土壤速效鉀含量(表1)，與Wen等[28]研究結(jié)果一致。

3.2 綠肥施用對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

土壤細(xì)菌對(duì)施肥方式極其敏感，土壤環(huán)境的微小變化可導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性產(chǎn)生顯著差異[29–31]。長(zhǎng)期施用綠肥顯著改變酸性紅壤稻田土壤細(xì)菌多樣性[7]，而本研究中綠肥處理并未顯著改變石灰性土壤細(xì)菌的多樣性(表2)，與嚴(yán)嘉慧等[8]和周艷飛等[32]研究結(jié)果一致。PCoA分析結(jié)果表明，不同施肥方式的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異(圖1D)。與CK相比，MF處理提高了變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度，降低了綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)等的相對(duì)豐度。此外，MF處理顯著增加了新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、互養(yǎng)棍狀菌屬(Syntrophorhabdus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)的相對(duì)豐度，降低了脫硫酸鹽菌屬(Desulfatiglans)的相對(duì)豐度(圖1B和C)。特定土壤條件導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落組成產(chǎn)生顯著差異，如土壤pH[33]、碳氮可利用性[34]和速效磷[35]等環(huán)境因子。RDA分析結(jié)果表明，土壤速效鉀是影響土壤細(xì)菌群落組成變化的關(guān)鍵環(huán)境因子，且多數(shù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與土壤速效鉀呈顯著正相關(guān)(圖2C和D)。土壤鉀主要來(lái)源于母質(zhì)礦化和生物地球化學(xué)循環(huán)補(bǔ)充，因此微生物可通過(guò)酸解、螯合、氧化還原等多種方式的協(xié)同作用對(duì)含鉀巖石生物轉(zhuǎn)化釋放鉀素[36]。本研究中交換性鈣離子含量與土壤細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，這是因?yàn)殁}離子具有影響微生物生長(zhǎng)、信號(hào)調(diào)節(jié)、基因表達(dá)等生理作用[37]。有研究表明，土壤交換性鈣離子是巖溶地區(qū)荒漠化過(guò)程中影響微生物群落動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵因子之一，可改變具有碳、氮代謝能力的土壤微生物群落組成，進(jìn)而影響土壤氮素的富集和有機(jī)碳的降解[38]。

3.3 綠肥施用對(duì)土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的影響

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，CK和MV處理的土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相似，而MF處理土壤細(xì)菌群落的網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜(圖3)，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性隨土壤養(yǎng)分(如土壤碳、氮的可利用性)增加逐漸復(fù)雜[39–40]，可見(jiàn)MF處理共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的提高與土壤有機(jī)碳、全氮和有效氮含量的提高密切相關(guān)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)在3種施肥方式中均占主導(dǎo)地位，但所占比重不同(表3)。MF處理下變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)類群在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的比重高于其他處理，綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等細(xì)菌類群的比重低于其他處理。變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為富營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌，在富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中快速繁殖[41]，如擬桿菌門(mén)主要分布在上層腐殖質(zhì)層或根際，在活性有機(jī)碳較高的環(huán)境中富集[42]。相反，綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等為寡營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌，具有緩慢生長(zhǎng)特性[43–44]，在營(yíng)養(yǎng)貧乏的土壤中普遍存在[45–47]。當(dāng)微生物所處環(huán)境的底物濃度變高時(shí)，富營(yíng)養(yǎng)性會(huì)取代寡營(yíng)養(yǎng)性群落定植在富裕的環(huán)境中[48]，說(shuō)明MF處理利于富營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌群落生長(zhǎng)，對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌群落生長(zhǎng)起限制作用。此外，MF處理的共現(xiàn)細(xì)菌類群多于CK和MV處理(表3)，說(shuō)明MF處理有利于土壤細(xì)菌群落共享生態(tài)位。

關(guān)鍵類群被認(rèn)為是微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要驅(qū)動(dòng)力[49]。Zhang等[50]對(duì)長(zhǎng)期施用綠肥的稻田土壤研究發(fā)現(xiàn)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)是酸性紅壤稻田的關(guān)鍵功能菌屬，其相對(duì)豐度在31年間翻了5.7～10倍，說(shuō)明細(xì)菌群落經(jīng)歷生態(tài)演替，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌占據(jù)特定生態(tài)位并發(fā)揮特定功能。本研究中地桿菌屬(Geobacter)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)和RBG-16-58-14為土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵菌屬。地桿菌屬是專性厭氧固氮菌，常見(jiàn)于淹水條件或深層土壤缺氧環(huán)境[51–52]，對(duì)硝酸鹽還原和鐵還原有重要作用[53]。厭氧繩菌屬是厭氧菌[54]，具有分解多種碳化合物的潛力[55]，與有機(jī)碳的降解和有機(jī)化合物的降解密切相關(guān)[56]，且適應(yīng)氨氮濃度較高的底物，可能具氨氧化功能[57–58]。而RBG-16-58-14被發(fā)現(xiàn)與沉積物種的硝酸鹽減少相關(guān)[59]，在水稻生態(tài)系統(tǒng)中還需進(jìn)一步證明。

4 結(jié)論

與單施化肥相比，綠肥處理均能提高土壤全氮含量，降低土壤pH、速效鉀含量和C/N值。不同施肥處理均未顯著改變細(xì)菌群落多樣性，綠肥配施化肥處理改變了土壤細(xì)菌在門(mén)和屬水平上的群落組成，土壤速效鉀、交換性鈣離子和全氮是影響土壤細(xì)菌群落組成變化的關(guān)鍵環(huán)境因子。單施化肥和單種綠肥處理的土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相似，綠肥配施化肥處理增加了土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性及變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等富營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌的相對(duì)豐度。因此，綜合3種施肥方式可知，綠肥配施化肥能提高土壤養(yǎng)分含量和改變土壤細(xì)菌群落組成，在巖溶區(qū)稻田生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用。