正常供磷及低磷脅迫下油菜種子植酸濃度與含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

劉海疆，李曉娟，謝毅文，吳海亞，魯明星，丁廣大，徐芳森，石 磊*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心, 湖北武漢 430070；3 武穴市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 湖北武穴 435400；4 湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳油菜辦公室, 湖北武漢 430070）

油菜是我國也是世界上重要的油料作物，每年種植面積約533萬hm2，總產(chǎn)1348多萬t[1–2]。菜籽油是國產(chǎn)食用油的第一大來源，在我國食用油市場中具有舉足輕重的地位，因此，推動油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展是我國植物油供給安全的重要保障[2]。磷是植物生長發(fā)育過程中所必需的大量營養(yǎng)元素之一[3]。植酸是種子中磷的主要貯存形式。植酸通常以植酸鉀、植酸鈣和植酸鎂等植酸鹽的形式積累在種子中。在種子萌發(fā)時，植酸水解成磷酸鹽和肌醇，并釋放出金屬離子，為種子萌發(fā)提供養(yǎng)分。油菜種子植酸磷占總磷80%左右，缺磷時油菜種子植酸磷和總磷均顯著降低[4–6]。菜籽餅是油菜榨油后的副產(chǎn)品，磷含量較高，其中65%是植酸磷[4]。但是，種子和餅粕中植酸并不能被人和其他非反芻類動物消化吸收，造成了磷和其他礦質(zhì)營養(yǎng)元素的浪費[7–8]。此外，植酸進入水體還可能導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化。因此，培育低植酸油菜品種成為油菜育種的一個重要目標(biāo)，解析其遺傳基礎(chǔ)對培育低植酸油菜品種具有重要意義。

植酸的合成是由葡萄糖-6-磷酸通過肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)氧化環(huán)化生成肌醇-3-磷酸開始的。隨后，肌醇單磷酸酶(IMP)通過去磷酸化作用將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為游離肌醇。同時，在肌醇激酶(MIK)的作用下，游離肌醇會再次被磷酸化生成肌醇-3-磷酸。之后，肌醇-3-磷酸通過不依賴脂類途徑合成肌醇-1,3,4,5,6-五磷酸，而肌醇通過依賴脂類途徑也形成肌醇-1,3,4,5,6-五磷酸。在肌醇多磷酸-2-激酶(IPK1)的催化作用下，肌醇-1,3,4,5,6-五磷酸生成植酸。最終，植酸通過多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP5)運輸?shù)降鞍踪A存液泡(PSV)中，與金屬陽離子螯合，以植酸鈣、植酸鎂和植酸鉀等植酸鹽形式儲存起來[9]。目前，在擬南芥、水稻、玉米以及油菜中已鑒定出幾種參與植酸生物合成的酶，如AtITPK1、AtITPK2、OsMRP5、ZmMRP4、BnPGK2、BnITPK1和BnITPK2[10–13]。除植酸合成和運輸相關(guān)基因外，一些影響種子植酸濃度的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因突變體也被鑒定出來。有研究表明，水稻OsSPDT基因影響磷向籽粒的運輸，從而影響種子中植酸的積累[14]。OsSPDT主要在莖節(jié)中表達，負責(zé)控制磷向籽粒的分配。與野生型相比，OsSPDT突變體種子中植酸磷降低25%～32%，但種子萌發(fā)與成熟期產(chǎn)量并未受到影響[14]。

前人利用遺傳群體，分別在水稻、擬南芥、綠豆等植物中鑒定到多個與植酸相關(guān)的遺傳位點(QTL)[15–16]。在水稻中，Stangoulis 等[15]利用粳稻Azucena和秈稻 IR64雜交培育的 DH遺傳群體鑒定到2個控制種子植酸含量的QTL，分別位于第5和第12條染色體上，表型解釋率分別為24%和15%，其中在第5條染色體上的QTL除與種子植酸含量相關(guān)外還和種子中總磷含量密切相關(guān)，對總磷含量的表型解釋率為20%。在擬南芥中，Bentsink等[16]利用擬南芥Cvi/Ler RIL 群體檢測到一個位于第3條染色體上的調(diào)控種子植酸含量和葉片植酸含量的多效QTL，該QTL可以分別解釋擬南芥種子和葉片植酸含量的61.8%和22.5%的表型變異。相比于連鎖分析，關(guān)聯(lián)分析具有定位精度高，無需構(gòu)建專門的遺傳群體，節(jié)省時間等優(yōu)點[17]。Archana等[18]以鷹嘴豆自然群體為材料，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，鑒定到1個與植酸含量相關(guān)的位于肌醇單磷酸酶基因的(CaIMP) 5'UTR 區(qū)域的簡單重復(fù)序列標(biāo)記NCPGR90，該標(biāo)記簡單重復(fù)序列長度的變化與鷹嘴豆種子植酸含量的高低相關(guān)。Perera等[19]通過GWAS分析鑒定到候選基因肌醇-3-磷酸合酶1(OsINO1)，在植酸積累過程中，與低植酸水稻品種WRC5相比，高植酸水稻品種WRC6的OsINO1的表達量上調(diào)了1.8倍，表明INO1在水稻種子植酸的積累過程中起著重要作用。

盡管植酸相關(guān)QTL在上述作物中已有報道，但在油菜中鮮有研究。本研究以來源于世界各地的403份甘藍型油菜為關(guān)聯(lián)分析群體，結(jié)合全基因組重測序獲得的530余萬高質(zhì)量SNP (single nucleotide polymorphism)標(biāo)記，對田間試驗正常磷和低磷處理油菜種子中的PA_Conc和PA_Cont進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定到與植酸合成相關(guān)的SNP位點及其候選基因，開展候選基因的關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析，鑒定優(yōu)異單倍型。研究結(jié)果將有助于解析甘藍型油菜種子植酸含量的遺傳機制，為低植酸油菜育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

關(guān)聯(lián)分析群體包括不同來源的油菜品種403份，其中350個半冬性、44個春性、8個冬性和1個未知種性品種。這些品種中，361個來源于中國，21個來自歐洲，8個來自日本，5個來自加拿大，4個來自澳大利亞，3個來自韓國，1個未知。

供試土壤為水稻土，其基本理化性質(zhì)：pH為5.61、有機質(zhì)為 7.37 g/kg、全氮為 0.91 g/kg、速效磷為 11.56 mg/kg、土壤全磷為 0.57 g/kg、土壤全鉀為13.2 g/kg。

1.2 田間試驗與性狀調(diào)查

上述油菜自然群體于2018年10月至2019年5月在湖北省武穴市梅川鎮(zhèn) (29.85°N，115.55°E)種植，試驗設(shè)置正常磷(P2O590 kg/hm2)和低磷(不施磷肥，P2O50 kg/hm2)兩個處理，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，采用隨機區(qū)組排列。每個重復(fù)每個品種種植4行，每行8個單株，共32株，行距20 cm，株距20 cm，每17個品種為一個小區(qū)，共144個小區(qū)。播種前，正常磷處理田塊的氮、磷、鉀和硼肥按108、90、120 和 1.6 kg/hm2作為基肥施入。施用肥料品種分別為尿素 (N 46.6%)、過磷酸鈣 (P2O512%)、氯化鉀(KCl 60%)和硼砂 (B 15%)。在播種 60 天后，按 72 kg/hm2追施氮素。不施磷處理除不施磷肥外，其余肥料施用與正常磷處理相同，試驗田的田間管理措施與當(dāng)?shù)赜筒颂锍Ｒ?guī)管理措施一致。待成熟時，選取3株長勢一致的植株進行取樣，測定種子中植酸濃度并計算植酸含量。

本試驗采用鐵沉淀法測定油菜種子中植酸濃度[20]，具體步驟如下：用萬分之一天平稱量5粒種子，記錄種子重量，放在1.5 mL離心管中，添加1 mL 0.4 mol/L HCl和 1 粒鎢球，利用 TissueLyser ball mill打樣機 (Qiagen, Germany)碾磨 3 min，以 15000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心后移取500 μL的上清液到1.5 mL 離心管。再以 15000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 5 min。最后吸取200 μL的離心后上清液于1.5 mL離心管備用，稱為原始樣品提取液。同時制備植酸標(biāo)準溶液，將50% (w/w)植酸溶液稀釋得到植酸溶液A (濃度 2.096 mg/mL)，將植酸溶液 A、0.4 mol/L HCl和0.2 mol/L HCl按照 1∶1∶14 的比例配制為 0.131 mg/mL植酸標(biāo)準溶液，利用0.2 mol/L鹽酸按照梯度稀釋法，稀釋得到4個濃度水平的植酸標(biāo)準溶液：0.131、0.0655、0.03275、0.016375 mg/mL。向 96 孔PCR 板中，每個孔中添加 15 μL 水和 30 μL 0.2 mol/L HCl，同時添加15 μL的樣品提取液。在不同的孔中，添加60 μL植酸標(biāo)準溶液，每式3份。將96孔PCR板以300 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 s，向每個孔中添加 120 μL 0.02% (w/v)硫酸鐵銨-0.2 mol/L HCl。96孔PCR板蓋帽后，在99℃加熱30 min，加熱后冰浴冷卻10 min。隨后樣品以3000 g相對離心力離心30 min。離心后將96孔PCR板中各樣品和植酸標(biāo)準溶液轉(zhuǎn)移80 μL到96孔酶標(biāo)板(平底)中。每個孔中添加 120 μL 顯色劑 1% (w/v) 2,2'-聯(lián)吡啶-1%(v/v)巰基乙酸，置于搖床混合10 min。利用KC4酶標(biāo)儀 (Bio-Tek Instruments, USA)讀取在 519 nm 的吸光度，每個孔讀取3次數(shù)值，以3次重復(fù)的平均值作為吸光度數(shù)值。計算后得到種子植酸濃度，以mg/g表示，含量以mg/5粒種子為單位。利用Microsoft Excel 2007 軟件初步整理表型數(shù)據(jù)，計算每個表型性狀的平均值、標(biāo)準差、變異系數(shù)，利用R中的psych軟件包(https://cran.r-project.org/web/packages/psych/)計算每個性狀的峰度與偏度，進行正態(tài)分布檢驗。

1.3 油菜關(guān)聯(lián)分析群體基因型評估

甘藍型油菜關(guān)聯(lián)分析群體全基因組重測序共獲得一千余萬的高質(zhì)量SNP標(biāo)記[21]。本研究采用MAF> 5%和缺失率<20%為標(biāo)準對該群體的所有SNP進行過濾，最終得到530萬SNP位點用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。對SNP的命名采用以下方法：chr (染色體chromosome的縮寫)開頭，加上該SNP所在的染色體，再接下劃線“__”，再加上該SNP在染色體對應(yīng)的物理距離。如，“chrA07__7809297”表示位于A07染色體上7809297bp處的一個SNP位點。為了降低群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響，使用 Admixture 軟件 (Alexander et al 2009)進行群體結(jié)構(gòu)分析[22]。使用Tassel 5.0軟件對該群體進行親緣關(guān)系分析，計算用于矯正關(guān)聯(lián)分析的K矩陣[23]。

1.4 油菜關(guān)聯(lián)分析群體兩個磷水平下PA_Conc和PA_Cont的全基因組關(guān)聯(lián)分析

在關(guān)聯(lián)分析中，群體結(jié)構(gòu)(Q)及品種間的親緣關(guān)系(K)會導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析結(jié)果存在一定的假陽性[24]。本研究采用TASSEL 5.0軟件中的只矯正群體結(jié)構(gòu)(Q)的一般線性模型和同時矯正群體結(jié)構(gòu)(Q)和親緣關(guān)系(K)的混合線性模型來進行關(guān)聯(lián)分析。用于篩選顯著關(guān)聯(lián)SNP位點的閾值設(shè)為1/n，n為SNP標(biāo)記數(shù)。根據(jù)關(guān)聯(lián)分析所計算的所有–lg(P)觀察值和期望值，利用R包GGplot2 (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)和 CMplot (https://cran.rproject.org/web/packages/CMplot/)分別繪制Manhattan 圖和 Quantile-Quantile散點圖 (QQ plot)。

1.5 候選基因預(yù)測

根據(jù) Wang等[25]的研究方法，將目標(biāo)SNP上下游300 kb距離范圍內(nèi)的基因作為初步候選基因，結(jié)合擬南芥同源基因的功能注釋，篩選確定候選基因。

1.6 候選基因關(guān)聯(lián)分析及單倍型分析

根據(jù) Li等[26]的研究方法，利用軟件bcftools對目標(biāo)候選基因BnaA07.MRP13的CDS區(qū)域及其前面2 kb范圍的SNP進行提取(http://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html)，將所獲得的SNP按照最小基因型頻率 (minor allele frequency，MAF) > 5% 和缺失率 (missing rate) < 20% 為標(biāo)準進行過濾，獲得高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。使用GLM模型對候選基因內(nèi)SNP和低磷脅迫下的PA_Cont進行候選基因關(guān)聯(lián)分析，挖掘BnaA07.MRP13內(nèi)與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的顯著SNP，隨后利用軟件Haploview.4.2對候選基因內(nèi)的顯著SNP進行單倍型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型油菜關(guān)聯(lián)群體正常磷和低磷處理種子中植酸濃度和植酸含量的遺傳變異

低磷和正常磷處理甘藍型油菜403個品種種子中PA_Conc和PA_Cont均呈連續(xù)性的正態(tài)分布，表現(xiàn)出廣泛的遺傳變異(表1、圖1)。其中，正常磷處理PA_Conc變異范圍為17.52～81.32 mg/g，均值為36.87 mg/g，變異系數(shù)為21.37%；低磷處理PA_Conc變異范圍為 17.47 ～49.05 mg/g，均值為 31.91 mg/g，變異系數(shù)為24.57%，與正常供磷相比，PA_Conc的均值下降13.5%。正常磷處理每5粒種子PA_Cont變異范圍為 0.30～0.99 mg，均值為 0.65 mg，變異系數(shù)為18.85% (表1)。低磷處理每5粒種子PA_Cont的變異范圍為 0.33～0.85 mg，均值為 0.58 mg，變異系數(shù)為18.91% (表1)與正常供磷相比，下降10.8%，PA_Cont的均值下降10.8%。與正常磷處理比較，低磷脅迫PA_Conc和PA_Cont分別下降4.96 mg/g和0.07 mg/5粒種子，但PA_Conc變異系數(shù)明顯增加(表1、圖1)。

表1 正常磷處理及低磷處理甘藍型油菜關(guān)聯(lián)分析群體種子植酸濃度和含量Table 1 Seed phytate concentration and content in an association panel of Brassica napus under sufficient and deficient phosphorus supplies

圖1 正常磷處理和低磷處理甘藍型油菜關(guān)聯(lián)分析群體種子植酸濃度和含量的頻率分布直方圖Fig. 1 Frequency distribution of phytate concentration and content of an association panel of Brassica napus under sufficient and deficient phosphorus supplies

2.2 正常磷和低磷處理甘藍型油菜種子植酸濃度和含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用GLM和MLM模型對正常磷和低磷處理油菜種子的PA_Conc和PA_Cont進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖2)。其中，利用GLM模型鑒定到正常磷處理與PA_Conc顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點42個，分別分布在 A01、A02、A03、A04、A05、A06、A09、A10、C01、C02、C04、C05、C06、C07、C08、C09等16條染色體上，解釋表型變異范圍為8.90%～13.89% (表2)；與 PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點1個，解釋表型變異為7.33% (表2)。低磷處理鑒定到與PA_Conc顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點6個，其中3個SNP位點分別分布在A03和A10兩條染色體上，解釋表型變異范圍為9.36%～14.28% (表2)；與PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)SNP位點7個，其中6個SNP位點分別分布在A02和A07兩條染色體上，解釋表型變異范圍為8.37%～12.10% (表2)。

圖2 正常磷和低磷處理油菜種子植酸濃度和含量全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖和QQ圖Fig. 2 Manhattan and QQ plots of GWAS on seed phytate concentration and content of Brassica napus under sufficient and deficient P supply

表2 正常磷和低磷處理甘藍型油菜種子植酸濃度和植酸含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點Table 2 Significant SNPs associated with phytate concentration and content in Brassica napus seed under sufficient and deficient phosphorus supplies

續(xù)表2 Table 2 continued

相比于GLM模型，MLM模型對群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系均進行了矯正，鑒定到的顯著關(guān)聯(lián)的位點較少，但MLM模型鑒定到的23個顯著SNP位點均與GLM共定位(表2)。其中，正常磷處理與PA_Conc顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點20個，分別分布在A03、A05、A06、A09、C01、C02、C04、C05、C06、C07等10條染色體上，解釋表型變異范圍為9.60%～13.89% (表2)。MLM模型沒有檢測到與正常磷PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，低磷處理鑒定到1個位于A03染色體上與PA_Conc顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，該位點可解釋的表型變異為14.28% (表2)；2個與PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，解釋的表型變異分別為11.18%和11.22% (表2)。

2.3 候選基因預(yù)測

基于甘藍型油菜Darmor-bzh參考基因組序列，對顯著關(guān)聯(lián)SNP位點前后300 kb范圍內(nèi)的基因進行分析，同時結(jié)合擬南芥同源基因的基因功能注釋，最終確定14個參與植酸合成和轉(zhuǎn)運途徑的基因作為候選基因(表3)。由GLM和MLM模型共同檢測到的植酸濃度和含量顯著關(guān)聯(lián)的23個SNP位點的候選基因有結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白MRP13(BnaA07g07310D，BnaA07g07320D)、MRP12(BnaA07g07330D)，肌醇1,3,4磷酸-5/6-激酶蛋白(BnaA10g17710D)，磷脂酰肌醇磷酸酶、磷脂酶C (BnaC09g33980D，BnaC 09g34000D，BnaC09g34010D)，磷酸甘油酸變位酶家族蛋白(BnaUnng04100D)以及磷轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白(BnaC06g37190D)等的編碼基因。此外，由GLM模型單獨鑒定到的油菜種子植酸濃度和含量顯著關(guān)聯(lián)SNP位點的候選基因有液泡轉(zhuǎn)運蛋白(BnaC07g 30170D)、磷脂酰肌醇-3,4-激酶(BnaC07g30200D)、磷脂酰肌醇單磷酸(BnaC04g24700D)以及類硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(BnaA03g04410D)的編碼基因(表3)。

2.4 BnaA07.MRP13候選基因關(guān)聯(lián)分析及單倍型分析

在A07染色體上由GLM和MLM模型同時鑒定到低磷處理植酸含量顯著關(guān)聯(lián)SNP位點chrA07__7809297，確定多藥耐藥相關(guān)蛋白的基因MRP13(BnaA07.MRP13)為該位點的候選基因(表3)。BnaA07.MRP13的CDS區(qū)域及其前面2 kb范圍內(nèi)共有19個SNP位點，將這19個SNP位點與低磷處理植酸含量進行候選基因關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，共有4個SNP位點與低磷脅迫下植酸含量顯著相關(guān)，且這4個SNP表現(xiàn)出很強的連鎖不平衡(圖3a)。對這4個SNP位點進行單倍型分析，共分成2種單倍型：高植酸單倍型“BnaA07.MRP13ContHap1”(TTTA)和低植酸單倍型“BnaA07.MRP13ContHap2”(CCCT) (圖3b)。高植酸單倍型“BnaA07.MRP13 ContHap1”具有218個油菜品種，其5粒種子的平均植酸含量為0.62 mg，低植酸單倍型“BnaA07.MRP13ContHap2”具有72個油菜品種，其5粒種子的平均植酸含量為0.56 mg (其他油菜品種SNP缺失，不計算在內(nèi))。含有“BnaA07.MRP13ContHap1”的品種在低磷脅迫下的植酸含量要顯著低于含有“BnaA07.MRP13ContHap2”的品種 (P= 0.0064)(圖3b)。

圖3 BnaA07.MRP13的候選基因關(guān)聯(lián)分析(a)和單倍型分析(b)Fig. 3 Candidate genes association analysis (a) and haplotype analysis (b) of BnaA07.MRP13

3 討論

3.1 甘藍型油菜種子植酸濃度和植酸含量顯著關(guān)聯(lián)的SNPs及其候選基因

磷肥的施用量顯著影響作物種子植酸濃度和含量[27–28]。研究表明，種子中植酸濃度與磷肥的施用量、磷肥在土壤中的有效性及溶解度顯著相關(guān)[29]。本研究正常磷與低磷處理分別檢測到42和6個與種子植酸濃度顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，分別檢測到1和7個與種子植酸含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(表2)。但是，在正常磷和低磷脅迫下沒有鑒定到相同的SNP位點。在 A07染色體上鑒定到1個低磷處理PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點和由 3個鄰近的 SNP位點組成的顯著 SNP 簇(表2)。這3個SNP位點中，chrA07__7809297和chrA07__7809300同時被GLM和MLM模型檢測到，預(yù)測BnaA07.MRP12(BnaA07g07330D) 和BnaA07.MRP13(BnaA07g 07310D，BnaA07g0732D)為該位點的候選基因(表3)。擬南芥AtMRP5編碼ABC 轉(zhuǎn)運子家族的多藥耐藥相關(guān)蛋白，負責(zé)將合成的植酸運輸至蛋白貯存液泡[30]。與野生型比較，水稻OsMRP5突變體植株籽粒植酸濃度降低35.8%～71.9%，無機磷濃度顯著提高，且無機磷的增加量要高于植酸濃度下降量[31]。BnaA07 g07330D、BnaA07g07310D和BnaA07g0732D均屬于MRP家族基因，很有可能參與油菜種子中植酸的運輸(表3)。低磷處理PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)SNP鑒定到硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族SULTR4;1(BnaA03g04410D)(表3)。水稻OsSPDT基因編碼硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，與野生型比較其突變體種子植酸濃度降低20%，而產(chǎn)量無顯著降低，這有利于減少水稻種子中植酸磷通過人和動物流向環(huán)境，減輕環(huán)境污染[14]。此外，低磷處理PA_Cont顯著關(guān)聯(lián)SNP位點還鑒定到液泡膜鐵轉(zhuǎn)運家族蛋白(VIT) (BnaC07g30170D)、肌醇或磷脂酰肌醇磷酸酶(BnaA02g34000D)以及參與將肌醇-6-磷酸(InsP6)合成肌醇-7-磷酸(InsP7)的激酶(BnaUnng04100D) (表3)。這些候選基因及其功能需要通過CRISPR-Cas9等分子生物學(xué)技術(shù)進一步驗證。

植酸含量是種子植酸濃度和種子質(zhì)量的乘積，因此，種子植酸含量與植酸濃度和種子質(zhì)量均相關(guān)。如果種子植酸含量的差異主要由植酸濃度決定，兩者的顯著SNP位點可能一樣；如果與兩者均有關(guān)，或者主要由種子質(zhì)量決定，兩者的顯著相關(guān)的SNP位點可能就不一樣(表2)。

3.2 甘藍型油菜低植酸品種的選育

作物種子中的磷是全球磷循環(huán)的主要驅(qū)動力，通過降低種子中植酸的濃度可以減少有限磷資源的浪費[32]。Matthus等[33]利用高效液相色譜法研究油菜種子的磷組成，發(fā)現(xiàn)油菜種子中的植酸濃度要顯著高于其他作物。研究人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了甘藍型油菜BnITPK1和BnITPK4基因的雙突變體，結(jié)果表明，與野生型比較，雙突變體種子植酸濃度顯著降低27.2%～35.3%；此外，雙突變體種子萌發(fā)、千粒重、株高、含油量以及產(chǎn)量與野生型無顯著差異[12–13]。這表明，通過編輯油菜中BnITPK1和BnITPK4可以實現(xiàn)低植酸育種。在本研究中，通過低磷脅迫油菜種子植酸含量鑒定到植酸合成最后一步的MRP家族基因BnaA07.MRP13。BnaA07.MRP13基因的候選基因關(guān)聯(lián)分析及單倍型分析結(jié)果表明，與低磷脅迫下植酸含量顯著相關(guān)的4個SNP構(gòu)成2種單倍型：“BnaA07.MRP13ContHap1”(TTTA)和“BnaA07.MRP13ContHap 2”(CCCT)。其中，“BnaA07.MRP13ContHap2”單倍型屬于低植酸單倍型，對于后續(xù)油菜低植酸育種研究具有重要意義。本研究油菜自然群體正常磷處理PA_Conc的變異幅度為17.52～81.32 mg/g，低磷處理PA_Conc變異范圍為17.47～49.05 mg/g。這些低植酸品種也可以作為低植酸育種的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

甘藍型油菜關(guān)聯(lián)分析群體正常磷和低磷處理種子植酸濃度和植酸含量均具有廣泛的遺傳變異。全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測到56個與種子植酸濃度和植酸含量顯著關(guān)聯(lián)的 SNP 位點，篩選和鑒定了14個與油菜種子植酸合成相關(guān)的候選基因，通過候選基因關(guān)聯(lián)分析以及單倍型分析鑒定了油菜種子高和低植酸單倍型“BnaA07.MRP13ContHap1”(TTTA)和“BnaA07.MRP13ContHap2”(CCCT)，這為解析油菜種子植酸濃度和含量的遺傳機制奠定了基礎(chǔ)，為低植酸品種的培育提供了優(yōu)異種質(zhì)和基因資源。但是，這些候選基因的功能及其決定高和低植酸單倍型的分子機制還不清楚，在今后的研究中，可利用CRISPR-Cas9 等技術(shù)創(chuàng)制候選基因的突變體，深入開展基因功能研究，明確這些基因影響種子植酸含量的生物學(xué)機制。