ABPPk 對施萬細(xì)胞血清剝奪損傷的保護作用機制研究*

仲晶飛，周家名，楊晉嫻，李枚原

（1 南通大學(xué)杏林學(xué)院醫(yī)學(xué)部，2 南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，南通 226001）

隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，全世界周圍神經(jīng)損傷的發(fā)病率逐年升高，周圍神經(jīng)損傷能引起患者部分或全部運動功能的喪失。由于周圍神經(jīng)再生能力差，致殘率高，給患者帶來沉重的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)。干性坐骨神經(jīng)痛作為一種常見的并發(fā)癥，通常是由創(chuàng)傷、擠壓、缺血、腫瘤等損傷刺激誘使坐骨神經(jīng)發(fā)生病變所引起的。作為周圍神經(jīng)中非常重要的膠質(zhì)細(xì)胞，施萬細(xì)胞（Schwann cells，SCs）包裹有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維，可以分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突生長和髓鞘化[1]。一旦SCs 發(fā)生損傷，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并限制周圍神經(jīng)功能恢復(fù)和再生[2]。因此，抑制SCs 凋亡將有助于提高周圍神經(jīng)的再生及功能恢復(fù)。

牛膝多肽（Achyranthes bidentata polypeptides，ABPP）是從中藥牛膝中提取的活性物質(zhì)，通過高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)進(jìn)一步提純，得到了生物活性更強的ABPPk[3]。ABPPk 可以有效保護因大腦缺血引起的原代皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，且可通過抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡來拮抗帕金森病[4]。目前ABPPk 對SCs 凋亡的保護作用已日趨深入和完善[5]，但其內(nèi)在分子機制仍有許多未知之處。本研究使用SCs 血清剝奪（serum deprivation，SD）模型，結(jié)合前期ABPPk 對SCs SD 損傷的保護作用，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)深入研究其作用機制，進(jìn)而探討ABPPk 對干性坐骨神經(jīng)痛及其他周圍神經(jīng)病變的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 SCs 培養(yǎng) 取新生Sprague-Dawley 大鼠，75%乙醇滅菌消毒，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，膠原酶/胰酶混合消化完全后離心棄上清液，加入含有10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并過篩網(wǎng)，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。均勻種于多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)皿中，置于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜，避光條件下?lián)Q成含有阿糖胞苷（10 μmol/L）的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后，換成含有Forskolin（2 μmol/mL）和HRG（10 ng/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 換液，直到細(xì)胞融合。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部后，胰酶消化，離心得到細(xì)胞沉淀，加入適量含有Thy 1.1（1∶1 000）的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并于冰上孵育2 h。離心，棄上清，加入含有補體的DMEM，輕輕吹打混勻后于37 ℃孵育30 min。離心后完全培養(yǎng)基清洗2 次，均勻種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜，換成含有Forskolin（2 μmol/mL）和HRG（10 ng/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 SCs SD 處理及分組 SCs 按照5×105/mL 密度種于6 孔板，過夜后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗2 次，分為4 組：正常對照組（Con 組）、SD 處理組（SD 組）、ABPPk處理組（ABPPk組）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）處理組（NGF 組）。其中Con 組加入完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，其余3 組更換為無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育4 h。然后，3組均棄無血清培養(yǎng)基，分別更換為完全培養(yǎng)基、含有ABPPk（0.5 μg/mL）的完全培養(yǎng)基、含NGF（0.1 μg/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序 使用Trizol（Life technologies）提取不同處理組SCs RNA，使用RNeasy 吸附柱（Qiagen）去除可能含有的DNA，得到高質(zhì)量RNA 樣品。以mRNA 短片段為模板合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴增，構(gòu)建好的RNA 文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)檢合格后，使用Illumina 測序儀進(jìn)行測序。得到的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析 進(jìn)行維恩圖（Veen Diagram）分析及聚類熱圖分析，運用差異表達(dá)基因的表達(dá)值進(jìn)行聚類分析，通過基因本體（gene ontology，GO）分析進(jìn)行基因分類和富集計算，進(jìn)一步對相關(guān)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用方差分析（ANOVA），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD處理后不同分組的維恩圖分析 對SD 組、ABPPk 組、NGF 組的主要差異基因進(jìn)行維恩圖分析，通過重疊交集發(fā)現(xiàn)共同表達(dá)以及特異表達(dá)的基因。分別有80 個、154 個和85 個基因在ABPPk 組、NGF 組及SD 組中特異性表達(dá)。其中，在ABPPk 組、NGF 組及SD 組中均表達(dá)的有12 個基因，在ABPPk組與NGF 組中均表達(dá)的有30 個基因（圖1，見封二）。

2.2 聚類熱圖分析 對不同處理的4 組SCs 的差異基因進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果顯示ABPPk 組和NGF 組中均有部分基因特異性表達(dá)。ABPPk 組中聚類熱圖上方區(qū)域有一部分基因特異性高表達(dá)，這部分基因在Con 組、SD 組中主要顯示負(fù)調(diào)控，而在NGF 組中也只有少部分顯示正調(diào)控。NGF 組中聚類熱圖下方區(qū)域也有一部分基因特異性高表達(dá)，這部分基因在Con 組、SD 組和ABPPk 組中也主要顯示為負(fù)調(diào)控（圖2，見封二）。

2.3 GO 富集分析及PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 通過聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，ABPPk 組上方區(qū)域有部分特異性高表達(dá)的基因；GO 富集分析結(jié)果顯示這些基因主要參與正向調(diào)節(jié)粒細(xì)胞分化、Rho 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)泛素化等生物學(xué)過程，其中的分子主要參與Rac GTPase 結(jié)合、鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合等相關(guān)功能；PPI 網(wǎng)絡(luò)分析顯示Rhog、Pak2、Yes1、Sptan1、Dock7、Mylpf、Myo9b、Mef2c、Fgf5等分子參與其中并發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3，見封二）。通過聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，NGF 保護組下方區(qū)域有部分基因特異性高表達(dá)；GO 富集分析結(jié)果顯示，這部分基因主要參與囊泡介導(dǎo)的運輸、胞吞作用、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，其中的分子主要參與促進(jìn)核糖體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA 結(jié)合、微管結(jié)合等功能；PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，Myl12b、Kalrn、Mapk6、Sgk1、Cdc42bpb、Cnot6、Bcl2l1、Cdkn2a、Myo5b等分子參與其中并發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖4，見封二）。

3 討論

周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)和功能重建仍然是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性難題，也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。緩慢的神經(jīng)再生、殘端變性、組織粘連、肌肉萎縮等因素會限制受損神經(jīng)的功能恢復(fù)[6]。此外，周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，在此過程中增殖的SCs 可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)軸突生長和髓鞘再生[7-8]。之前關(guān)于周圍神經(jīng)再生的研究[9]主要集中在構(gòu)建組織工程移植物以及SCs中的分子調(diào)控機制和信號通路等方面。而周圍神經(jīng)再生的藥物治療是另一個研究重點。即使一些神經(jīng)營養(yǎng)因子已被選擇并用于外周神經(jīng)損傷治療，仍然存在許多不足，如療效不佳、成本過高或缺乏特異性靶向作用[10]。因此，未來的研究應(yīng)著眼于尋找范圍廣泛的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的活性成分，將其開發(fā)為保護SCs 并促進(jìn)軸突生長的新藥。

本研究結(jié)果表明，ABPPk 和NGF 對SCs 缺血的保護作用機制有所不同，主要調(diào)控分子也不同。ABPPk 與NGF 對SCs 的分化、損傷保護與細(xì)胞功能的維持表現(xiàn)出一定的相似性，不同的是ABPPk 還主要參與細(xì)胞間信號傳遞、細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)泛素化等生物學(xué)功能，并有Rhog、Pak2、Yes1、Mef2c、Dock7 等部分核心基因參與其中。而NGF 組中Kalrn、Mapk6、Sgk1、Cdc42bpb、Cnot6 等核心基因主要參與囊泡介導(dǎo)的運輸、胞吞作用、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。Rhog 是Rac 亞家族的成員，已被發(fā)現(xiàn)對許多細(xì)胞類型中的肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。Rhog 還可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞功能，包括神經(jīng)突生長、細(xì)胞遷移和侵襲[11]。Pak2 是Pak 家族激酶的成員，在應(yīng)激信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Pak2 可以通過與小GTPase、Cdc42 和Rac1 結(jié)合或通過caspase 3 裂解激活。Cdc42 激活的Pak2 介導(dǎo)細(xì)胞停滯，而caspase 3 裂解激活的Pak2 主要參與細(xì)胞凋亡[12]。Nrg1 受體Erbb2 通過磷酸化Tyr-1118 直接結(jié)合并激活Dock7，Dock7 充當(dāng)Erbb2 的細(xì)胞內(nèi)底物以促進(jìn)SCs 遷移。Dock7 還可以通過海馬神經(jīng)元中的Rac1 調(diào)節(jié)軸突和樹突的極性形成，Dock7 介導(dǎo)的Rho GTPase 激活可能導(dǎo)致最終觸發(fā)髓鞘形成的極性復(fù)合物的產(chǎn)生[13]。這些關(guān)鍵基因相互作用，共同參與調(diào)節(jié)ABPPk 對SCs SD 損傷的保護作用。

綜上，與現(xiàn)有的神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF 相比，ABPPk研發(fā)的藥物在急性期周圍神經(jīng)損傷患者的治療中具有廣闊的前景。本研究在原有傳統(tǒng)經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，運用現(xiàn)代生物學(xué)先進(jìn)的高通量技術(shù)，將傳統(tǒng)中藥與先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，更加深入全面地研究ABPPk和NGF 對SCs 缺血損傷的保護作用。將有助于加深對ABPPk 的功能和機制的理解，促進(jìn)新治療靶點的發(fā)現(xiàn)，為周圍神經(jīng)損傷的臨床治療提供實驗和理論基礎(chǔ)。