缺氧誘導(dǎo)因子-1α參與肝纖維化形成機(jī)制研究進(jìn)展*

劉瑞清 綜述，袁小澎 審校

1 肝纖維化

肝纖維化是所有慢性肝病所經(jīng)歷的共同中間途徑，在酒精、病毒和遺傳性疾病等多種因素作用下，在肝細(xì)胞損傷修復(fù)的過(guò)程中伴隨著損傷修復(fù)慢性化，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。伴隨膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積[1]，導(dǎo)致肝硬化。肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化在上述過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的作用[2]。當(dāng)HSC活化后，除了自身分泌作用外，還發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和調(diào)節(jié)肝臟生長(zhǎng)和修復(fù)平衡的作用[3]，成為纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵細(xì)胞。HSC活化受到多種促纖維化介質(zhì)的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)這些介質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程中，HIF-1α起著十分重要的作用[4]。

2 HIF-1α

2.1 HIF-1α結(jié)構(gòu) HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的組成部分，α亞基(通常為HIF-1α或HIF-2α)與β亞基(HIF-1β也稱為芳基烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白)一起組成HIF-1。HIF-1α是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基，是主要的功能亞基，對(duì)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性起著關(guān)鍵性作用。在常氧條件和沒(méi)有其他代謝紊亂的情況下，HIF的α亞基被脯氨酰-羥化酶(PHD1，PHD2或PHD3)快速羥基化，進(jìn)而被蛋白酶體降解。因此，在常氧狀態(tài)下HIF-1α的含量極低[5]。在缺氧條件下，HIF-1α降解受阻，被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，在核內(nèi)聚集，與HIF-1β形成二聚體，進(jìn)而通過(guò)與缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合而促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄生成多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[6]。

2.2 HIF-1α與肝損傷 研究表明，在使用乙醇、對(duì)乙酰氨基酚(APAP)和四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠，HIF-1α均能被檢測(cè)到高表達(dá)。在APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型，HIF-1α缺陷能夠使得小鼠在6小時(shí)內(nèi)免受APAP肝毒性作用，并且降低肝組織中性粒細(xì)胞積累和血漿白細(xì)胞介素-6水平，調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌，改善APAP刺激后的炎癥反應(yīng)[7]。在膽管結(jié)扎(BDL)肝纖維化小鼠中，相較于對(duì)照模型組，HIF-1α缺陷能夠使得小鼠肝組織I型膠原(Collagen I)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白質(zhì)水平減少，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PGDF)和纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA水平亦明顯減少[4]。體外實(shí)驗(yàn)表明，缺氧能夠激活HIF-1α調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而這些基因可能改變HSC對(duì)某些激活劑和趨化因子的敏感性，并調(diào)節(jié)血管生成和膠原合成重要的基因表達(dá)[8]。

3 HIF-1α與肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路

3.1 HIF-1α/TGF-β1與HIF-1α/VEGF信號(hào)通路 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是免疫反應(yīng)、炎癥、基質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和分化等許多領(lǐng)域的必需介質(zhì)，亦是參與肝纖維化過(guò)程的主要促纖維化細(xì)胞因子。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，抑制TGF-β1表達(dá)和調(diào)節(jié)TGF-β-Smad信號(hào)通路是預(yù)防肝纖維化的有效方法[9]。在胚胎中的器官生長(zhǎng)和成年人受傷組織的修復(fù)過(guò)程中，血管將氧氣運(yùn)送到遠(yuǎn)處的器官，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，發(fā)揮至關(guān)重要的作用。當(dāng)血管生長(zhǎng)不平衡時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)病[10]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有促進(jìn)不同來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建的作用, 能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)血管生成，在新生血管生成過(guò)程中起著十分重要的作用[11]。相關(guān)研究表明，兩種人正常肝細(xì)胞系：QSG-7701和L02細(xì)胞，在缺氧培養(yǎng)6小時(shí)后，HIF-1α、TGF-β1和VEGF表達(dá)表現(xiàn)出增加趨勢(shì)，并在24小時(shí)達(dá)到較高水平。當(dāng)予以序列特異性siRNA對(duì)HIF-1α表達(dá)進(jìn)行抑制后，能夠顯著降低缺氧肝細(xì)胞中TGF-β1和VEGF的表達(dá)，表明TGF-β1和VEGF可能是HIF-1α的潛在靶基因。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的TGF-β1和VEGF表達(dá)也與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)趨勢(shì)相同，并且也在HIF-1α被抑制后表達(dá)降低。將培養(yǎng)缺氧肝細(xì)胞的上清液添加到HSC細(xì)胞培養(yǎng)基中可以增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的HSC活化，也即表明，在低氧狀態(tài)下HIF-1α能夠誘導(dǎo)VEGF和TGF-β1表達(dá)增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)并增強(qiáng)HSC的活化，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[12]。HIF-1α還能協(xié)同其他基因增強(qiáng)對(duì)VEGF表達(dá)的誘導(dǎo)作用。例如，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Osx或HIF-1α可分別使VEGF啟動(dòng)子活性增加3.6倍和3.3倍。當(dāng)共轉(zhuǎn)染同等量的Osx和HIF-1α?xí)r，可協(xié)同作用使VEGF啟動(dòng)子活性增強(qiáng)9.3倍[13]；E2F7/8與HIF1能夠形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以刺激VEGFA啟動(dòng)子活性[14]；缺氧時(shí)，HIF-1α和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)[15]。因此，研究證據(jù)表明，HIF-1α能夠與VEGF直接相互作用，即VEGF可能是HIF-1α的直接靶基因。

二甲雙胍通過(guò)抑制HIF-1α能抑制VEGF的表達(dá)，抑制基于HSC的血管生成，抑制纖維化的進(jìn)展[16, 17]。塞來(lái)昔布聯(lián)合奧曲肽能夠通過(guò)抑制肝內(nèi)和肝外血管生成，協(xié)同改善誘導(dǎo)大鼠的肝纖維化和門靜脈高壓，其機(jī)制可能與p-ERK-HIF-1a-VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑失活有關(guān)，表明HIF-1α與VEGF的信號(hào)通路還受上游信號(hào)的調(diào)控[18]。因此，針對(duì)HIF-1α有抑制作用的藥物一方面能夠抑制TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化等下游反應(yīng)；另一方面，能抑制VEGF的表達(dá)，抑制血管生成，進(jìn)而影響肝纖維化形成或進(jìn)一步發(fā)展為肝癌。

3.2 HIF-1α誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)通路 細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，其中溶酶體降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和入侵的微生物[19]，通常由缺氧或饑餓激活[20]。在缺氧條件下，對(duì)LX-2細(xì)胞予以siRNA使HIF-1α的表達(dá)減少后，能夠使與細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-II和Beclin-1表達(dá)減少。當(dāng)對(duì)LX-2細(xì)胞予以脂多糖(LPS)刺激時(shí)，能夠誘導(dǎo)其自噬活性、HSC活化以及HIF-1α的積累增加，表明除了缺氧條件下，在炎癥微環(huán)境下細(xì)胞自噬和HIF-1α增加也是HSCs活化的重要機(jī)制[20]。細(xì)胞自噬與HIF-1α的積累相關(guān)。因此，抑制HIF-1α的產(chǎn)生或增加HIF-1α的降解能夠使細(xì)胞自噬過(guò)程得到抑制，進(jìn)而抑制HSC的活化過(guò)程。H3K4me3，即組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的三甲基化，是染色質(zhì)中組蛋白甲基化修飾的重要標(biāo)記，參與基因表達(dá)的激活。缺氧能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的H3K4me3組蛋白甲基化修飾[21]。當(dāng)對(duì)LX-2細(xì)胞予以二氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)后，HIF-1α和H3K4me3逐漸增加，且免疫共沉淀表明缺氧LX-2細(xì)胞HIF-1α轉(zhuǎn)錄復(fù)合物H3K4me3組蛋白發(fā)生甲基化修飾，故抑制組蛋白甲基化修飾能夠使缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬受到抑制，從而抑制HIF-1α通過(guò)自噬誘導(dǎo)的HSC活化。此外，CoCl2誘導(dǎo)缺氧導(dǎo)致HIF-1α核轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制組蛋白甲基化修飾可抑制HIF-1α的核轉(zhuǎn)位，表明組蛋白甲基化在HIF-1α核轉(zhuǎn)運(yùn)中亦起重要作用[22]。甲基硫腺苷能夠抑制組蛋白甲基化修飾[23]，從而影響HIF-1α誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和HSCs活化，抑制肝纖維化進(jìn)程，但由于組蛋白甲基化修飾涉及其他基因的調(diào)節(jié)作用，故抑制此過(guò)程的負(fù)向作用也有待進(jìn)一步研究。

4 HIF-1α表達(dá)相關(guān)信號(hào)通路

4.1 HIF-1α/ mTOR通路 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路調(diào)節(jié)許多重要細(xì)胞過(guò)程，在生長(zhǎng)和分裂細(xì)胞的基礎(chǔ)生理學(xué)中起到了核心作用[24]。mTOR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于HSC的激活至關(guān)重要，為纖維化肝臟中ECM的關(guān)鍵來(lái)源。西羅莫司(雷帕霉素)和依維莫司作為mTOR的抑制劑，可顯著降低纖維化率達(dá)70%，在CCL4肝纖維化模型大鼠，HIF-1α以及p-mTOR(mTOR的活性形式)表達(dá)量明顯增高，當(dāng)予以一種能減輕肝纖維化的中藥成分芍藥甙干預(yù)時(shí)，兩者表達(dá)均明顯減少[25]。在低氧條件下，HSCs中的p-mTOR水平顯著增加，當(dāng)予以mTOR抑制劑后，能夠降低HIF-1α和VEGF表達(dá)，從而抑制HIF-1α和VEGF導(dǎo)致的血管生成及纖維化進(jìn)展[16]。mTOR抑制劑能夠減輕纖維化，并且能夠抑制HIF-1α的相關(guān)作用機(jī)制。因此，通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α通路抑制肝纖維化進(jìn)程具有可行性，但由于mTOR涉及較多正常細(xì)胞生理過(guò)程，當(dāng)其受到抑制時(shí)，是否會(huì)有其他嚴(yán)重的不良反應(yīng)還有待探究。

4.2 HIF-1α/ NF-κB通路 核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)是轉(zhuǎn)錄因子家族的總稱，是調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄的重要因子。研究表明，缺氧狀態(tài)下，HIF被激活，可以進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB亞基向核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，而NF-κB可反饋性調(diào)節(jié)HIF-1α轉(zhuǎn)錄，增加其表達(dá)[26]。但研究表明，NF-κB可能具有促纖維化和抗纖維化的雙重作用，其抗纖維化的作用可能與抑制Collagen I基因表達(dá)有關(guān)。因此，在纖維化進(jìn)程中，NF-κB活化能夠促進(jìn)HIF-1α的積累，同時(shí)具有一定的抗纖維化活性[27]，故通過(guò)抑制NF-κB活性來(lái)抑制HIF-1α的積累可能涉及到促纖維化與抗纖維化的平衡，具有雙面性。

4.3 HIF-1α/ERK通路 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，正常定位于胞漿，當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。ERK家族包括ERK1和ERK2，調(diào)節(jié)細(xì)胞許多重要生理作用。研究表明，在缺氧條件下，ERK1/2信號(hào)通路能夠提高HIF-1的活性[28]。此外，抑制MAPK磷酸化能夠增強(qiáng)HIF-1α泛素化，并抑制HIF-1α易位進(jìn)入細(xì)胞核[29]。研究發(fā)現(xiàn)，核HIF-1α蛋白存在于肝硬化患者肝臟的巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促纖維化介質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子[30]。肝纖維化大鼠HIF-1α和p-ERK表達(dá)升高，予以姜黃素處理后能夠使HIF1α和p-ERK表達(dá)降低，大鼠纖維化程度減輕，表明HIF-1α可能至少部分通過(guò)ERK途徑促進(jìn)肝纖維化[31]。因此，通過(guò)抑制ERK通路可能抑制HIF-1α的活性或核轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)纖維化程度起到一定程度的抑制作用。

5 HIF-1α降解相關(guān)信號(hào)通路

5.1 HIF-1α/琥珀酸信號(hào)通路 檸檬酸循環(huán)(CAC)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體。研究表明，在缺血再灌注損傷時(shí)，檸檬酸循環(huán)的中間體琥珀酸的異常積累會(huì)作為一種代謝信號(hào)誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)產(chǎn)生[32]。在關(guān)于非酒精性脂肪性肝炎的研究中發(fā)現(xiàn)，琥珀酸能夠誘導(dǎo)促纖維化因子TGF-β1、α-SMA和IL-1β表達(dá)，而上述因子能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)活化HSC。當(dāng)對(duì)HIF-1α基因進(jìn)行敲低處理后，上述因子表達(dá)減少；反之，當(dāng)予以HIF-1α活化劑CoCl2后，上述因子的表達(dá)增多，表明HIF-1α是琥珀酸鹽誘導(dǎo)炎癥和激活HSC這一過(guò)程必需的因子[33]。在有氧狀態(tài)下，HIF-1α能夠不斷合成，又迅速被PHD降解。因此，PHD受損是HIF-1α積累的主要原因[34]。琥珀酸能夠抑制HSC中PHDs活性，使HIF-1α的羥基化受損，保持HIF-1α的穩(wěn)態(tài)進(jìn)而導(dǎo)致HIF-1α積累。在巨噬細(xì)胞中，琥珀酸鹽還能通過(guò)削弱PHD活性來(lái)誘導(dǎo)ROS的發(fā)生進(jìn)而誘導(dǎo)HIF-1α積累[35]。

5.2 HIF-1α與VHL通路 von-Hippel-Lindau蛋白(VHL)是HIF-1α與HIF-2α的重要調(diào)節(jié)因子，常氧細(xì)胞中VHL的失活會(huì)導(dǎo)致HIF積累活化，表明VHL是HIF降解所必需的重要因子，VHL蛋白還可調(diào)節(jié)許多器官與細(xì)胞的纖維化過(guò)程。在肝組織，肝細(xì)胞VHL的條件性失活可導(dǎo)致肝臟炎癥和肝臟脂肪變性。人類丙型肝炎、酒精性和膽汁淤積性肝硬化患者肝組織VHL表達(dá)受到顯著抑制，并同時(shí)伴隨著HIF-1α和HIF-2α的積累。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，VHL過(guò)表達(dá)可以減輕模型小鼠肝纖維化。當(dāng)特殊不易降解的活性HIF-1α或HIF-2α存在時(shí)，纖維化的改善效果將會(huì)減弱，表明VHL調(diào)節(jié)纖維化的過(guò)程依賴HIF-1α和HIF-2α。值得注意的是，在BDL小鼠，單獨(dú)沉默HIF-1α或HIF-2α可抑制肝纖維化，同時(shí)沉默HIF-1α和HIF-2α可進(jìn)一步減弱纖維化；在CCl4組模型小鼠，單獨(dú)沉默HIF-2α對(duì)減輕肝纖維化的作用更加顯著，表明HIF-2α可能在病毒性肝纖維化病變起主導(dǎo)作用[36]。

5.3 HIF-1α/YAP通路 HIF-1α在缺氧條件下的積累可以誘導(dǎo)下游靶基因如VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)的轉(zhuǎn)錄和釋放，進(jìn)一步促進(jìn)未成熟血管生成，阻止血竇和肝細(xì)胞之間的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，加重肝細(xì)胞損傷[37]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)在包括肝纖維化的慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[38]。當(dāng)予以HIF-1α的抑制劑ACF時(shí)能夠降低LSEC中缺氧誘導(dǎo)的VEGF-A和CD31的表達(dá)升高，表明HIF-1α與VEGF和CD31的表達(dá)有關(guān)。YAP作為致癌基因能夠影響細(xì)胞增殖、衰老、化學(xué)抗性和血管生成。當(dāng)予以YAP siRNA后，抑制了YAP的表達(dá)，同時(shí)VEGF-A和CD31的表達(dá)降低，予以YAP質(zhì)粒使其表達(dá)增加時(shí)則使VEGF-A和CD31的表達(dá)增高。兩部分結(jié)果表明YAP可能通過(guò)促進(jìn)HIF-1α在LSEC中的積累而發(fā)揮促血管生成作用。但另有研究表明，YAP的干預(yù)不能顯著改變HIF-1αmRNA水平，可能由于YAP通過(guò)控制蛋白酶體介導(dǎo)的HIF-1α降解過(guò)程來(lái)影響HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性，但不影響HIF-1α的基因轉(zhuǎn)錄[37,39]。YAP/HIF-1α通路與HIF-1α的降解相關(guān)，故可考慮研究使相關(guān)的蛋白酶體失活或者阻斷YAP的相應(yīng)受體從而減輕HIF-1α的積累，促進(jìn)其正常降解，進(jìn)而減輕肝纖維化進(jìn)程。