冠狀病毒感染性疾病尸體檢驗相關(guān)病原學(xué)檢測回顧與展望

王韻怡，周南，樂嘉誠，張凱，趙乾皓，鄭大，胡丙杰，成建定

1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東 廣州511436

冠狀病毒（coronavirus，CoV）是一類廣泛存在于自然界、直徑80～160 nm、基因組全長27～32 kb、可引起人畜共患病的單股正鏈RNA 病毒。這類病毒在分類上屬套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，有包膜，表面有多形性花冠狀突起，包括突起（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、小膜（envelope，E）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白4 種結(jié)構(gòu)蛋白[1]。冠狀病毒主要引起呼吸及消化系統(tǒng)疾病，其中嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠狀病毒、中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS）冠狀病毒分別在2003 年和2012 年在全球引起了感染大流行，2019 年年底，SARS-CoV-2 來襲，引發(fā)了嚴(yán)重的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情。

冠狀病毒傳染性較強，重癥死亡率較高。冠狀病毒感染性疾病在短短17 年之內(nèi)發(fā)生3 次世界大流行，強烈提示此類疾病的防治將是我們未來的一項長期工作，值得高度重視。病原學(xué)檢測不僅是臨床確診傳染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，也是傳染性疾病尸體檢驗、病原學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前，SARS-CoV-2陽性與COVID-19 臨床病程的動態(tài)變化關(guān)系尚未闡明，如病程中的患者病毒核酸檢測陰性、康復(fù)出院患者核酸檢測再次陽性等問題十分突出。在此類傳染病死者的尸體檢驗中開展細致的病原學(xué)研究，對于揭示病毒感染人體的途徑、靶器官及其時空分布規(guī)律，并進一步闡明其致病機制，對指導(dǎo)臨床患者的病原學(xué)診斷、療效和康復(fù)判斷具有十分重要的意義。本文通過系統(tǒng)介紹冠狀病毒感染性疾病SARS 和MERS 等尸體檢驗病例的病原學(xué)研究情況，以期為正在流行的COVID-19 及今后可能的冠狀病毒感染性疾病尸體解剖的病原學(xué)研究提供借鑒和參考。

1 SARS

SARS 又稱非典型肺炎，是由SARS-CoV 引起的累及多器官的傳染性疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難等呼吸道癥狀。

1.1 光鏡觀察

通過常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色或特殊麥?zhǔn)希∕acchiavello）染色法，光鏡下即可觀察 到 病 毒 包 涵 體[2-3]。LANG 等[4]將3 例SARS 死 亡 患者的肺組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，HE 染色，在肺泡上皮內(nèi)檢見病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)，呈球形、類似紅細胞大小、嗜酸性染色、帶空暈的均質(zhì)無結(jié)構(gòu)小體。賴日權(quán)等[5]對1 例SARS 死亡患者部分肺組織進行Macchiavello 染色，在肺泡上皮細胞、單核巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)檢見病毒包涵體。

1.2 透射電鏡觀察

將尸體檢驗各部位標(biāo)本用2.5%戊二醛溶液固定，1%鋨酸溶液后固定，梯度脫水，浸透，環(huán)氧樹脂制劑Epon812 包埋，超薄或半薄切片、定位，可在透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）下觀察是否存在病毒顆粒[6]。趙景民等[7]在1 例SARS 死亡解剖病例組織標(biāo)本中，觀察到肺組織中多數(shù)Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞及細小支氣管上皮細胞、部分肺泡間隔毛細血管內(nèi)皮細胞內(nèi)，淋巴結(jié)和脾內(nèi)部分單核巨噬細胞、淋巴細胞內(nèi)，以及部分心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)和腎小管上皮細胞的胞質(zhì)或擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可查見較多病毒顆粒。

1.3 病毒分離與滴定

由于受到樣本儲存、切片制備以及觀察方法等影響，有時并不能在組織切片中觀察到病毒顆粒，必要時可進行病毒分離，具體方法可參考文獻[8]。趙景民等[7]在患者鼻咽拭子、含漱液、腎等組織分離到SARSCoV。朱雷等[9]分別采集1 例SARS 死者解剖病例的心、肺、肝、脾等組織，接種細胞后，源于心、肺標(biāo)本者在第1 代即可分離出病毒，而源于肝、脾標(biāo)本者則在第2 代分離出病毒，說明心、肺標(biāo)本病毒含量較肝、脾標(biāo)本高，進一步證實SARS-CoV 可以感染患者多個主要器官，且對心、肺組織侵害強于肝、脾組織。

1.4 病毒核酸檢測

病毒核酸檢測是病毒病原學(xué)檢測中最關(guān)鍵的一種手段，包括全基因組測序和核酸特異性片段檢測。病毒RNA 的來源通常是組織標(biāo)本直接提取物，常用的核酸片段檢測方法大致可以分為核酸測序和核酸原位雜交（in situhybridization，ISH），而核酸檢測的目標(biāo)片段一般選擇SARS-CoV 基因特異性片段或其RNA 聚合酶基因片段。

1.4.1 SARS-CoV基因特異片段檢測

晏輝鈞等[10]采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和巢式PCR 擴增等方式，從3 例SARS 死者的部分肺組織中擴增出了SARS-CoV RNA 的兩段cDNA 序列。秦杰[11]則應(yīng)用病毒RNA 檢測盒從一些尸體檢驗標(biāo)本的鼻咽吸取物和血漿中提取出病毒RNA。

國際上采納較多的是檢測SARS-CoV 編碼N 蛋白和主要抗原S 蛋白的N 區(qū)和S 區(qū)片段，這些片段高度保守，具有代表性，檢出率較高。朱雷等[9]以尸體檢驗各組織的病變細胞提取的RNA 為模板成功擴增出部分S 區(qū)和N 區(qū)的cDNA 片段產(chǎn)物。

1.4.2 SARS-CoV RNA聚合酶基因檢測

在病毒的復(fù)制增殖過程中，RNA 聚合酶起重要作用，其基因具高度保守性，因此還可通過檢測其RNA聚合酶基因來檢驗病毒的存在。洪濤等[12]在SARS 死者肺組織中擴增出CoV RNA 聚合酶基因片段。張慶玲等[13]則對尸體檢驗組織切片進行原位雜交，檢測其中的SARS-CoV 聚合酶RNA 的表達，結(jié)果顯示，多個部位存在陽性雜交信號，且主要分布于呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等。另外，尸體檢驗標(biāo)本的內(nèi)分泌器官雖有較強的RNA 表達，但并沒有出現(xiàn)明顯的病理形態(tài)學(xué)改變，值得注意。

1.5 病毒相關(guān)蛋白檢測

抗原是尸體檢驗中病毒相關(guān)蛋白檢測的主要對象。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）是尸體檢驗中最常用的一種檢測手段，對于法醫(yī)學(xué)鑒定具有重要意義。研究者們多使用抗N、S 蛋白的單克隆抗體進行檢測，NICHOLLS 等[14]制備了SARS-CoV核蛋白特異性單克隆抗體，對32 例SARS 死亡患者的尸體檢驗肺組織進行IHC 染色得到陽性信號。賀莉等[15]對4 例SARS 死者的多個器官組織石蠟切片用抗SARS-CoV N 蛋白單克隆抗體進行IHC 染色，結(jié)果顯示，標(biāo)本的肺上皮細胞、脾和淋巴結(jié)浸潤的單核細胞等細胞質(zhì)內(nèi)均呈強陽性表達。該團隊還利用抗SARS-CoV S 蛋白單克隆抗體成功檢測到僅在各器官血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme，ACE2）表達陽性的細胞中存在強陽性信號[16]。許慧等[17]用全病毒抗原免疫，制備了具有更好反應(yīng)性的抗SARS-CoV 單克隆抗體，并對2 例肺標(biāo)本切片進行IHC 染色，也得到了陽性結(jié)果，鏡下有大量棕黃色病毒顆粒。

另外還有多種如膠體金試紙、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等檢測特異性抗體的試劑盒可選用。

2 MERS

MERS 是由MERS-CoV 引起的一種表現(xiàn)為急性肺炎伴發(fā)腎功能衰竭的冠狀病毒感染性疾病，雖與SARS-CoV 同屬冠狀病毒，但作用的受體不同，基因上存在明顯差異。MERS 病死率較SARS 高，由于發(fā)病數(shù)量相對較低，且主要集中在中東地區(qū)阿拉伯半島，因解剖條件受限，有報道的尸體檢驗病例數(shù)較少。

2.1 病毒核酸檢測

病毒核酸特異性片段的擴增方法包括多重探針的RT-PCR 和不依賴溫度循環(huán)的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）檢測等，目的基因可包括病毒基因組開放性讀碼框upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因等保守區(qū)域[18]。此外，國內(nèi)外還開發(fā)了等溫情況下的重組酶輔助擴增（recombinase aided amplification，RAA）技術(shù)的RT-RAA[19]和反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）[20]等短時高效的MERS-CoV檢測方法。

2.2 病毒相關(guān)蛋白檢測

YAMAOKA 等[21]制備了抗MERS-CoV N 抗原的單克隆抗體，建立了雙抗體夾心的ELISA 和膠體金檢測方法。SONG 等[22]利用特異性N 蛋白單抗，制備了針對N 抗原的膠體金快速檢測試紙條，都可用于MERS-CoV 抗原的組織切片檢測。

除此之外也有多種檢測血液中特異性抗體的試劑盒，如間接免疫熒光法的試劑盒等。

3 COVID-19

COVID-19 是由SARS-CoV-2 引起的急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2 對人群普遍易感，擴散能力強，發(fā)病人數(shù)多，其癥狀可能輕微、甚至無任何臨床表現(xiàn)，但重癥患者易出現(xiàn)多種并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。從全球目前的疫情看，總體上COVID-19 的病死率可能低于SARS 和MERS。

3.1 TEM觀察

已有課題組在TEM 下成功觀察到呈球狀或橢圓形、包膜完整、表面有規(guī)律排列的冠狀突起、略呈光暈或花環(huán)狀、核心呈高電子密度的SARS-CoV-2 病毒顆粒[23]。YAN 等[24]利用冷凍TEM 和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)首次成功解析了SARS-CoV-2 表面S 蛋白受體結(jié)合域與細胞表面受體ACE2 全長蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)和相互作用方式，證實了冠狀病毒的器官分布與人體ACE2 蛋白的分布密切相關(guān)，有助于進一步了解病毒入侵人體的機制，并由此提示尸體檢驗病原學(xué)檢測的可取材部位。

3.2 病毒的分離

除利用Vero 細胞進行傳代培養(yǎng)外，LU 等[25]采用特殊致病性的人氣道上皮細胞（human airway epithelial cells，HAE）進行病毒分離，將患者的咽拭子或肺泡灌洗液接種于HAE 細胞，通過經(jīng)典的科赫法進行病毒的初步鑒定。

3.3 病毒核酸檢測

已有報道[26]利用高通量宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）的基因組測序技術(shù)方法測得SARS-CoV-2 的全基因組完整序列。WANG 等[27]還研發(fā)了納米孔靶向測序（nanopore targeted sequencing，NTS）的創(chuàng)新性技術(shù)，陽性檢出率較熒光定量RT-PCR 高。多重PCR 擴增子測序能夠從病毒載量極低的極端樣本中獲取全基因組信息，其成本較低，更適用于尸體檢驗病原學(xué)檢測。

冠狀病毒的快速檢測大多是對高度保守的靶標(biāo)序列ORF1a、ORF1b、N、E基因片段的識別，實時熒光RT-PCR 是目前SARS-CoV-2 檢測應(yīng)用最廣泛的一種。有研究[28]結(jié)果表明，新鮮尸體組織和經(jīng)10%甲醛溶液固定的石蠟包埋（formalin fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織均能通過PCR 檢測到SARS-CoV RNA。雖然10%甲醛溶液固定過程會對RNA 產(chǎn)生修飾，限制了RNA 的應(yīng)用，F(xiàn)FPE 組織被認為不是獲得原始RNA 的最佳選擇，但可從這些來源中回收可擴增RNA。許三鵬等[29]將COVID-19 術(shù)后4 d 死者的肺組織病理石蠟樣本進行總RNA 提取，發(fā)現(xiàn)石蠟切片中提取的RNA 質(zhì)量能滿足病毒檢測要求，能夠使用熒光定量PCR 和核酸檢測試劑盒進行檢測，提示除了痰液、鼻咽拭子、呼吸道抽取物、肺和氣管灌洗液、肺活檢組織、眼結(jié)膜和肛拭子外，還可將石蠟標(biāo)本作為病毒檢測的補充。由于已有證據(jù)[28-29]證明，尸體組織和FFPE 切片均可提取到滿足核酸檢測條件的病毒RNA，因此，可以嘗試將臨床上病毒核酸檢測的方法運用在尸體病原學(xué)檢測上，如LAMP、高靈敏度的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、同時檢測同一病毒多種不同亞型的多重RT-PCR、聯(lián)合探針、基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short panlindromic repeats，CRISP）的基因編輯技術(shù)CRISPR/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)（CRISPRassociated systems，Cas）檢測靶向RNA、高通量基因芯片以及切口平移法快速篩查等。

3.4 病毒相關(guān)蛋白檢測

在法醫(yī)學(xué)尸體檢驗和鑒定過程中，因法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚無專業(yè)性實驗室進行病毒的分離和檢驗，因此可選擇對病毒相關(guān)蛋白進行檢測。臨床上目前基于抗原和抗體檢測的即時檢驗產(chǎn)品中，大多數(shù)是以IgG、IgM 為檢測目標(biāo)的試劑盒，可用于法醫(yī)現(xiàn)場快速篩查檢測，而一些單克隆抗體產(chǎn)品則適用于IHC 等抗原檢測方法。

3.4.1 病毒抗原檢測

檢測方法包括IHC、Western 印跡法、ELISA 單克隆抗體夾心、免疫膠體金法、免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）和高通量化學(xué)發(fā)光技術(shù)等。市面上已經(jīng)有可用的抗SARS-CoV-2 S、N 蛋白的單克隆抗體，可用于IHC，還有研究將其應(yīng)用于IFA 并成功檢測到細胞中病毒抗原[30]。Western 印跡法是一種通過特異性抗體檢測特定抗原的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，可用于檢測病毒本身表面蛋白的表達或借抗原檢測特異性抗體的存在與活性，但操作較復(fù)雜，免疫模式較固定，且需內(nèi)參，否則結(jié)果的準(zhǔn)確性無法保障。國外有研究[31]利用COVID-19 患者恢復(fù)期血清作一抗，識別出轉(zhuǎn)染Vero 細胞總蛋白中SARS-CoV-2 N、S、E 抗原的蛋白條帶。免疫色譜試紙條和ELISA 均可對抗原或抗體進行檢測，前者簡便省時但靈敏度、特異度不高，后者靈敏度、特異度高，方法靈活，但通量小、費時長?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)同樣可用于檢測抗原或抗體，其靈敏度、特異度高，但檢測設(shè)備成本也高。已有高通量化學(xué)發(fā)光SARS-CoV-2 快速檢測商業(yè)試劑盒，可同時滿足抗原、抗體的檢測需求，可考慮應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實踐中的病毒檢測。

3.4.2 病毒特異性抗體檢測

血清學(xué)檢測特異性抗體IgG、IgM 的主要方法多為膠體金免疫層析法、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、免疫熒光法和ELISA。LI 等[32]開發(fā)的IgM-IgG 聯(lián)合抗體檢測試劑盒在15 min 內(nèi)即可通過外周血快速篩查COVID-19，靈敏度和特異性分別達88.66%和90.63%?；谝陨细鞣椒ǖ膯稳朔菘焖倏贵w測試卡，操作簡單易觀察，有望應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場快速檢測。另有研究[33]采用ELISA 檢測基于重組的SARS-CoV-2 N 蛋白和S 蛋白所構(gòu)建的重組蛋白的IgM、IgG 抗體，結(jié)果顯示，基于N 蛋白和S 蛋白的抗體［IgM 和（或）IgG］檢測陽性率分別為80.4%和82.2%，且檢測陽性率隨著患病天數(shù)的增加而增加，ELISA 法靈敏度高，尤其適用于患病10 d 后患者血清標(biāo)本的檢測，可作為COVID-19診斷的重要補充方法。

4 尸體檢驗病原學(xué)檢測的實踐問題

4.1 檢測方法的選取

SARS-CoV-2 的病原學(xué)檢測方法在臨床實踐中不斷發(fā)展和更新，但由于尸體檢驗工作的特殊性，部分檢驗方法無法在法醫(yī)學(xué)實際工作中應(yīng)用。盡管如此，傳染病尸體檢驗的病原學(xué)檢測策略仍能從臨床中獲得啟發(fā)與思考。例如：疑似COVID-19 死者的現(xiàn)場勘驗或尸體檢驗前，可嘗試?yán)蒙虾＝淮笞T蔚泓院士團隊[34]研發(fā)的一種針對SARS-CoV-2 的便攜式家庭簡易快速檢測試劑盒，該試劑盒僅需對深部氣管吸液或鼻咽部分泌物進行檢測，實現(xiàn)了對病毒的現(xiàn)場、快速檢測。另外，僅需滴血的IgG-IgM 聯(lián)合抗體檢測試劑簡便快捷、靈敏度高、特異性強，有望開展其在法醫(yī)學(xué)實踐中的現(xiàn)場運用。有團隊利用SARS-CoV S重組蛋白片段和Western 印跡法，反向檢測待測血清中是否存在相應(yīng)的抗體，并與檢測特異性抗體的ELISA 試劑盒進行比較，發(fā)現(xiàn)Western 印跡法在ELISA 陰性和部分類似SARS 癥狀的ELISA 陽性病例中有其鑒別意義[35]。法醫(yī)學(xué)SARS-CoV-2檢測也可嘗試使用COVID-19 患者恢復(fù)期血清作為檢測抗體，進行Western 印跡法檢測病毒抗原，或開發(fā)病毒抗原重組片段對待測血清進行反向檢測。對于受死后變化影響較大的樣本，也可嘗試采用CRISPR/Cas 基因編輯、多重PCR 擴增子測序等所需病毒滴度低、靈敏度高的技術(shù)進行檢測。

另外，重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)簡單、快速、靈敏，成本低，耗時短，穩(wěn)定且易于保存[36]，對抑制劑具有很大的耐受性；依賴核酸序列擴增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）的檢測儀便攜、適用范圍廣，可實時觀測結(jié)果，對靶RNA 定性、定量，擴增效率和靈敏度也較高[37]，屬于高通量檢測方法。這兩種技術(shù)均適于快速檢測。而適配體是一種單鏈寡聚核苷酸，其制備簡便、要求低，親和力強，穩(wěn)定性更佳，可以替代抗體作為抗原檢測的探針[38]，目前已有許多研究應(yīng)用適配體對病毒蛋白或全病毒進行檢測。第三代反義肽核酸（antisense peptide nucleic acid，antisense PNA）是一種人工合成的多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA 類似物，具有更高的雜交穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性，已用于多種病毒的檢測，在PCR、熒光原位雜交等領(lǐng)域有較廣闊的應(yīng)用，其過程快速、靈敏、高效、準(zhǔn)確、成本低，可檢出更多突變信息[39]。這些技術(shù)在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用有待進一步研究，以期探索出適用于法醫(yī)學(xué)病原體檢驗的方法。

4.2 檢測結(jié)果的影響因素

死后變化對病原學(xué)檢測結(jié)果有較大的影響。一方面，若死亡時間過長，死后細胞自溶可能造成病毒定位和核酸提取困難，廣泛存在的RNA 酶會使不穩(wěn)定的病毒RNA 大部分降解，導(dǎo)致可獲片段過短或過少，無法得到準(zhǔn)確的結(jié)果；另一方面，機體內(nèi)蛋白質(zhì)會在細胞自溶后釋放的水解酶和腐敗菌的作用下按照一定的規(guī)律逐步降解，死亡時間過長，就有可能檢測不到特異性抗體或病毒抗原。賴日權(quán)等[5]發(fā)現(xiàn)，在死后即刻的穿刺組織中，肺泡內(nèi)單核巨噬細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞的胞漿或擴張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可見清晰的冠狀病毒顆粒，而在死后12 h 的肺組織中病毒顆粒結(jié)構(gòu)模糊，辨別較為困難。陳德蕙[40]認為，在尸體組織TEM 樣品制備中，固定非常關(guān)鍵，組織一旦離開血液供應(yīng)，必須立即固定，間隔時間越短越好，否則會發(fā)生明顯的細胞自溶，在細胞內(nèi)的各種病原微生物超微結(jié)構(gòu)保存不佳，可能會失去原有形態(tài)特征，容易與衣原體混淆。

除了死后變化，死者的病程長短也對檢測結(jié)果有影響。據(jù)有關(guān)研究[14]報道，在發(fā)病后2 周內(nèi)死亡的7 名SARS 患者中，有4 名患者的尸體檢驗樣本中出現(xiàn)SARS-CoV N 蛋白陽性染色結(jié)果，其中死于出現(xiàn)癥狀5 d 后的2 例患者病毒感染細胞數(shù)量最多，而在發(fā)病2 周后死亡的25 例患者中沒有檢測到定位信號。該結(jié)果提示，發(fā)病2 周后肺組織細胞中的病毒復(fù)制呈下降狀態(tài)，且發(fā)病10～15 d 后從樣本中通過RT-PCR 檢測到的病毒載量開始減少，可能與特異性抗體的出現(xiàn)有關(guān)。因此推斷冠狀病毒肺炎患者病程在2 周內(nèi)者，尸體檢驗時較大可能檢測出病毒陽性結(jié)果，而病程大于2 周者，由于機體免疫清除、細胞死后自溶等因素的影響，一般較難出現(xiàn)陽性結(jié)果。

4.3 尸體檢驗樣本的獲取、保護與檢測

在尸體檢驗開始前的現(xiàn)場檢測中，對于死亡時間較短的，可利用外周血、口腔拭子或其他分泌物進行快速的病毒篩查，以便預(yù)防病毒傳播。需注意的是，由于SARS-CoV-2 主要引起下呼吸道感染，取氣管、支氣管分泌物要優(yōu)于鼻咽分泌物，亦可嘗試取腦脊液作樣本。若通過尸體檢驗進行確診，則在尸體檢驗時應(yīng)以靶器官或病變嚴(yán)重器官（如肺組織）為主要檢測樣本。若研究病毒在體內(nèi)的侵襲分布規(guī)律，則應(yīng)廣泛獲取器官組織（如腎、腸等）。若所取組織塊為石蠟切片，則應(yīng)立即置于4%甲醛溶液或2.5%戊二醛溶液中固定保存。若直接進行病毒核酸分析，組織塊應(yīng)用裝有病毒滅活液的保存管保存并立即在2～8 ℃下轉(zhuǎn)運送檢，不能立即檢測的需4 ℃或冰上短期保存，提取的RNA 樣本應(yīng)儲存于-70 ℃。分泌物應(yīng)使用專用拭子采樣后置于含核酸酶抑制劑的病毒保存液中，拭子與體液樣本用一次性密封容器封閉其外包裝并用75%乙醇溶液消毒，4 ℃保存。標(biāo)本需給予特殊標(biāo)識并應(yīng)在2～4 h 內(nèi)盡快送檢。尸體檢驗過程中的注意事項及人員防護可參考文獻[41-42]。

標(biāo)本接收后用75%乙醇溶液消毒外包裝，檢測前建議56 ℃45 min 滅活，死后即刻肺穿刺者可在TEM下直接觀察，行組織切片者可進行Macchiavello 染色后光鏡觀察，或行IHC 染色。石蠟切片和組織塊、分泌物、外周血等可進行病毒RNA 提取后利用實時熒光RT-PCR、LAMP 或原位雜交技術(shù)檢測核酸特異性片段，由于病毒可能發(fā)生變異，一般需分別在ORF1a、ORF1b、N基因上選取2 個靶標(biāo)，或在E基因上選取第三個靶標(biāo)，也可進行全基因組的高通量測序，如多重PCR 擴增子測序或探針捕獲測序。所有實驗室檢測過程（如RT-PCR 等）應(yīng)在生物安全防護（BSL）二級以上的實驗室的生物安全柜中進行（病毒分離和尸體檢驗等則需在BSL-3 設(shè)施中進行），并注意個人防護。完成檢測后應(yīng)用75%乙醇溶液消毒工作空間并做好個人清潔，剩余的檢材和廢物應(yīng)經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后按照醫(yī)療廢物的規(guī)定丟棄。

現(xiàn)有病原學(xué)檢測方法主要服務(wù)于臨床病原學(xué)診斷和研究領(lǐng)域，能夠?qū)Σ《镜拇嬖?、滴度以及不同器官時空分布特征進行診斷。通過借鑒臨床的病原學(xué)檢測手段，有望在法醫(yī)學(xué)尸體檢驗中引入操作簡便、診斷快速、結(jié)果可靠的技術(shù)，或開發(fā)敏感性高、更適用于尸體組織、病理切片中病原學(xué)檢測的方法與技術(shù)，以解決尸體檢驗組織受死后變化等因素限制而導(dǎo)致的RNA 易降解、含量低、取材難的問題。在COVID-19 等冠狀病毒感染性疾病的尸體檢驗中開展系統(tǒng)深入的病原學(xué)研究，不僅對法醫(yī)病理學(xué)上病變部位的尋找、疾病的確診以及最后的死因鑒定都具有重要的實用價值，而且可望闡明此類病毒侵襲、感染、損害人體器官的時空規(guī)律，為研究冠狀病毒感染性疾病的發(fā)病機制和臨床防治策略提供科學(xué)依據(jù)。