豬源致病性大腸桿菌分離與鑒定方法研究

劉桂梅，王韋華

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000)

0 引言

大腸桿菌是一種十分常見(jiàn)的動(dòng)物腸道寄居群，它廣泛存在并且時(shí)刻威脅著公共衛(wèi)生安全[1-2]。試驗(yàn)從陜西關(guān)中地區(qū)的豬養(yǎng)殖場(chǎng)采集豬源致病性大腸桿菌，對(duì)其分別進(jìn)行分離和鑒定。

1 材料來(lái)源

無(wú)菌采集陜西關(guān)中地區(qū)豬養(yǎng)殖場(chǎng)的具有感染癥狀的瀕死豬的內(nèi)臟40份進(jìn)行分離與鑒定。

2 菌落培養(yǎng)

將所收集的內(nèi)臟等器官組織每份取出適量加入稀釋液進(jìn)行研磨后過(guò)濾離心，再取其上清液接種在培養(yǎng)基上，維持37℃恒溫，菌落培養(yǎng)完成后置于4℃環(huán)境下保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

3 革蘭染色鏡檢

無(wú)菌條件下取出之前培養(yǎng)完成的菌落，然后使用革蘭染色進(jìn)行鏡檢，染色步驟分為涂片、初染、媒染、脫水、復(fù)染、鏡檢，涂片過(guò)程要維持無(wú)菌狀態(tài)，初染要注意將染液完全沖洗干凈，復(fù)染要維持染液染色30 s，鏡檢要等到標(biāo)本片完全干燥后才可以進(jìn)行，先使用低倍勁和高倍鏡最后使用油鏡。再將菌落分別接種到麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂以及SS培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)37℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。

4 抗原血清型鑒定

取上述菌落進(jìn)行接種，培養(yǎng)基為普通瓊脂，接種完成后將其置于37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)24 h，然后再使用石炭酸生理鹽水沖洗培養(yǎng)基，沖洗下菌苔，將其收集于圓底試管中，制成濃稠的懸液，塞上試管的塞子后，對(duì)其進(jìn)行2 h的121℃高壓處理，破壞菌落的K抗原。冷卻后使用特定血清對(duì)其進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，再設(shè)置一組生理鹽水的混合物作為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)照，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組是否會(huì)出現(xiàn)凝集顆粒，并根據(jù)這一現(xiàn)象判斷菌落所屬的血清型。如果在30 s內(nèi)出現(xiàn)了明顯的凝集者表示該反應(yīng)為陽(yáng)性。

5 毒力基因檢測(cè)

首先根據(jù)國(guó)際國(guó)內(nèi)公布的基因序列，參照相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)豬源致病性大腸桿菌設(shè)計(jì)毒力基因，再對(duì)用培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行生理鹽水滅菌、洗滌以及稀釋后，將其作為細(xì)菌的DNA 模板，開(kāi)始進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)在溫度為94℃的條件下進(jìn)行10 min，再進(jìn)行循環(huán)、退火等一系列操作后結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠開(kāi)始電泳驗(yàn)證。一般為菌落設(shè)計(jì)9種毒力基因分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析討論。

細(xì)菌的DNA模板提取具體過(guò)程如下。

1)取少量培養(yǎng)的細(xì)菌液于試管內(nèi)，離心后將上清去除干凈。

2)向第一步中所獲得的沉淀物也就是細(xì)菌菌體加入緩沖液A后，進(jìn)行振蕩直到菌體懸浮，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3)向試管內(nèi)加入蛋白酶溶液，再次振蕩，將菌體與蛋白酶溶液充分混合。

4)再向試管內(nèi)加入緩沖液B，經(jīng)過(guò)振蕩、靜置，溶液變得清亮之后，去除掉試管內(nèi)壁可能存在的水珠。

5)加入無(wú)水乙醇，經(jīng)過(guò)振蕩后，試管內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)部分絮狀沉淀，稍稍離心后，去除掉試管內(nèi)壁出現(xiàn)的水珠。

6)將步驟5)得到的溶液以及可能會(huì)出現(xiàn)的絮狀沉淀加入一個(gè)吸附柱，再次離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

7)向上一步驟所得的吸附柱內(nèi)加入緩沖液C，該緩沖液應(yīng)事先進(jìn)行加入無(wú)水乙醇的處理，再次離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

8)向吸附柱內(nèi)加入緩沖液D，同樣事先進(jìn)行了加入無(wú)水乙醇的處理，離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

9)再次重復(fù)上一步驟。

10)將吸附柱放置在收集管中并進(jìn)行離心，將廢液倒掉。再將吸附柱在室溫條件下靜置幾分鐘，以此來(lái)晾干之前材料中尚有殘余的漂洗液。

11)最后取出一個(gè)干凈的離心管，將吸附柱放置其中，滴加洗脫緩沖液，再次靜置，離心后將溶液收集起來(lái)，存放到離心管內(nèi)。

6 小白鼠的致病性實(shí)驗(yàn)

1)首先制備感染菌液，將分離后的菌株在培養(yǎng)基上進(jìn)行37℃恒溫培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)18 h后挑取到肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，再經(jīng)過(guò)12 h的37℃恒溫振蕩培養(yǎng)。

2)將一定數(shù)量的小白鼠等量分為8組，1組5只。其中前7組作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組，最后一組作為該實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組使用不同的分離菌株進(jìn)行37℃的恒溫培養(yǎng)，再將其注入到小白鼠體內(nèi)，對(duì)照組則只注入營(yíng)養(yǎng)液，分別注入后觀察小白鼠的臨床表現(xiàn)。

3)每2 h記錄小白鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況等臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察15 d，記錄各小組內(nèi)小白鼠的死亡情況。

4)發(fā)生死亡后對(duì)小白鼠進(jìn)行解剖觀察，并將小白鼠的各器官組織在無(wú)菌條件下取出后將其制作為病理切片，并再次對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分離并鑒定。

7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

1)根據(jù)培養(yǎng)基的培養(yǎng)特性以及革蘭染色結(jié)果來(lái)判斷分離菌株是否符合大腸桿菌的特征。鏡檢時(shí)看到菌落為短小桿菌，革蘭氏呈陰性。把分離細(xì)菌之后的培養(yǎng)物接種在麥康凱培養(yǎng)基上并維持37℃進(jìn)行培養(yǎng)后，菌落表面光滑，呈現(xiàn)濕潤(rùn)的粉紅色且菌落的邊緣整齊；將其接種到伊紅美蘭瓊脂上并維持37℃進(jìn)行培養(yǎng)后，菌落光滑反光，呈現(xiàn)黑色或者棕綠色；接種在SS培養(yǎng)基上，維持37℃進(jìn)行培養(yǎng)后菌落不生長(zhǎng)。這些都是符合大腸桿菌的形態(tài)以及生理特征。此外對(duì)于可疑菌落要對(duì)其單獨(dú)進(jìn)行氧化酶等實(shí)驗(yàn)并使用鑒定系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2)血清型的鑒定結(jié)果要根據(jù)玻片凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)豬源致病性大腸桿菌的血清型以及菌株類型進(jìn)行具體的分析。毒力基因檢測(cè)、藥物的敏感性分析都要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體結(jié)果進(jìn)行討論分析。

3)小白鼠的致病性實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的對(duì)比，更為直觀地展示了豬源致病性大腸桿菌對(duì)動(dòng)物體內(nèi)各器官組織的危害。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)豬源致病性大腸桿菌對(duì)小白鼠具有很強(qiáng)的致病性，豬源致病性大腸桿菌對(duì)人類和動(dòng)物存在著極大的威脅，應(yīng)該引起人們的關(guān)注。

8 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)上文所述，豬源致病性大腸桿菌的鑒定與分離方法有了一個(gè)較為詳盡的思路，但是也應(yīng)該看到豬源致病性大腸桿菌的研究任重而道遠(yuǎn)，對(duì)于該類細(xì)菌的研究已經(jīng)涉及到了眾多學(xué)科，包括動(dòng)物醫(yī)學(xué)、食品衛(wèi)生安全學(xué)以及人類醫(yī)學(xué)等。在當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)手段下，對(duì)于豬源致病性大腸桿菌的感染還沒(méi)有行之有效的治療方案和治療藥物，因此人類和動(dòng)物的預(yù)防感染就顯得尤為重要，而要想加強(qiáng)對(duì)食品安全的監(jiān)督與檢測(cè)，就必須尋找更加高效的針對(duì)豬源致病性大腸桿菌的鑒定方法和檢測(cè)手段。