肝竇內(nèi)皮細胞與非酒精性脂肪性肝病的研究進展

曹婕露,嚴峻彬,吳錦婷,陳芝蕓

曹婕露,嚴峻彬,吳錦婷,陳芝蕓,浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江省杭州市 310006

0 引言

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的,由代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的疾病,主要包括非酒精性肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)[1].約22%的NASH患者會進展至晚期纖維化[2].雖然生活方式的改變可以控制風險因素,但目前還沒有可用于治療NAFLD的特效藥物療法.

近年來NAFLD的發(fā)病機制已得到廣泛研究,“多重打擊”假說認為多種損傷共同作用于遺傳易感性受試者可誘發(fā)NAFLD,其中首要的“打擊”因素為肝細胞的胰島素抵抗和脂肪毒性[3].有研究表明除了骨骼肌、脂肪組織和肝細胞外,膳食脂肪可誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)的胰島素抵抗[4].同時,氧化應(yīng)激、脂肪毒性和腸道細菌內(nèi)毒素等“打擊”因素也能加重LSECs損害、促進NAFLD病理變化[5].因此,LSECs可能為NAFLD的發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié).

肝臟由實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞構(gòu)成,在非實質(zhì)細胞中,內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)所占比例最大.小鼠肝臟中ECs約占所有標記細胞的22%,僅次于肝細胞[6].大多數(shù)ECs沿肝竇非連續(xù)性排列,這一部分被為LSECs.LSECs是肝星形細胞和肝細胞之間、肝臟脂肪組織與腸道血液之間高度專業(yè)化的內(nèi)皮細胞[7],生理狀態(tài)下是維持肝臟穩(wěn)態(tài)的守門人,而病理條件下在慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[8].本篇綜述簡要介紹了穩(wěn)態(tài)條件下LSECs獨特的生理結(jié)構(gòu)和生理功能,討論了NAFLD進展的主要階段中LSECs的病理變化(包括毛細血管化、血管生成、血管收縮、促炎和促纖維化)及其影響因素,還涉及以上結(jié)構(gòu)功能改變?nèi)绾瓮苿蛹膊〉膼夯?總結(jié)了相關(guān)的信號通路,提出了LSECs靶向治療的可行性.

1 LSECs的生理結(jié)構(gòu)和功能

LSECs在結(jié)構(gòu)上具有多方面的獨特性,LSECs形成肝竇壁,通過特殊的細胞間連接緊密連結(jié),內(nèi)含大量跨膜的直徑約為50-150 nm的窗孔[9].窗孔在其生命周期內(nèi)能不斷改變其位置和直徑,甚至通過開合來調(diào)控細胞內(nèi)外物質(zhì)和信息的交換[10].肌動蛋白、纖連蛋白、肌球蛋白和鈣調(diào)蛋白組成LSECs的細胞骨架,在窗孔的動態(tài)改變中起著重要作用.細胞松弛素B、細胞松弛素D可促進肌動蛋白解聚[9,11].LSECs表面覆蓋著多種清除受體,以識別內(nèi)部和外部危險相關(guān)的分子,細胞質(zhì)中含有具有攝取功能的囊泡和細胞器,運輸和降解內(nèi)吞的物質(zhì).

這種獨特的結(jié)構(gòu)使得LSECs具有高滲透性和強內(nèi)吞能力,在正常肝臟中,LSECs可以充當血漿蛋白、脂蛋白、代謝物、小乳糜微粒殘余物、病毒顆粒和其他直徑小于窗孔的納米顆粒的選擇性屏障[12].LSECs通過選擇性滲透、內(nèi)吞這兩種方式調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移[13],在血液與肝實質(zhì)的脂質(zhì)交換、乃至全身脂質(zhì)體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用.LSECs還是控制白細胞進入肝實質(zhì)的屏障,發(fā)揮抗炎的作用[14].

LSECs通過旁分泌作用協(xié)調(diào)肝再生和抑制炎癥、纖維化.在部分肝切除的小鼠中,LSECs通過釋放血管分泌因子Wnt2和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)誘導(dǎo)肝血管新生,從而促進肝細胞增殖與肝再生[15].LSECs能維持肝臟穩(wěn)態(tài),保持肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)和庫普弗細胞(kupffer cells,KCs)的靜止狀態(tài)[16].此外,LSECs的旁分泌作用也體現(xiàn)在釋放包含特定信號分子的“微囊泡”和外泌體,目前對這兩種結(jié)構(gòu)的認識尚在初始階段,已有研究證明成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)信號對“信號囊泡”的釋放具有重要意義[17].

LSECs也是一種重要的機械傳感器[18],能夠響應(yīng)增加的血流剪應(yīng)力產(chǎn)生血管擴張劑,以減輕血壓的增加,此過程由內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)錄因子KLF2介導(dǎo)[19].最近還發(fā)現(xiàn)血管灌注和血管壁的機械拉伸會激活LSECs中的β1整合素和血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)信號軸,誘導(dǎo)HGF表達,觸發(fā)肝細胞的增殖[20].

2 LSECs參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展

在穩(wěn)態(tài)條件下,LSECs表現(xiàn)出強內(nèi)吞能力、抗炎和抗纖維化的表型,它們還調(diào)節(jié)血管生成和再生,并且根據(jù)內(nèi)環(huán)境機械力的變化調(diào)節(jié)血管舒張[8].一些研究表明,在NAFLD早期階段,LSECs具有很強的適應(yīng)性,能發(fā)揮一定的抗炎作用.Kus等[21]發(fā)現(xiàn),在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型中,LSECs的窗孔直徑增加,但數(shù)量得以保留;抗炎性前列腺素的激活釋放、炎癥負調(diào)節(jié)因子MCPIP1基因過度表達可能抵消炎癥的發(fā)生,連同LSECs對生物能增減的適應(yīng)性,可能會在減緩NAFLD進程,但不排除在細胞分離過程中窗孔數(shù)目改變的可能性.短時間(16 h)暴露于游離脂肪酸的人類和小鼠LSECs,通過MAPK依賴途徑下調(diào)參與單核細胞和巨噬細胞招募的促炎趨化因子[22].盡管如此,更多的研究表明,在遭受持續(xù)性肝損傷后,LSECs會迅速改變其結(jié)構(gòu)和功能,從而損害肝臟的再生反應(yīng).

2.1 肝竇毛細血管化 在損傷刺激下,LSECs最早最顯著的形態(tài)學改變被認為是肝竇毛細血管化,其特征是是窗孔的缺失并伴隨基底膜基質(zhì)在LSECs的管腔表面異常沉積[21].Miyao等[23]證明毛細血管化可能普遍發(fā)生于肝單純脂肪變性到NASH早期階段的過程中,并逐漸惡化至NASH晚期.毛細血管化的影響因素尚未完全確定,可能與飲食中能量多少[24]和營養(yǎng)物質(zhì)的分布[25]有關(guān).后者影響體內(nèi)腸道菌群和游離脂肪酸的變化,與LSECs開窗的孔隙率之間存在聯(lián)系[25].由細胞外基質(zhì)和間質(zhì)膠原在Disse空間中沉積而形成的基底膜也有助于窗孔的丟失和關(guān)閉,從而阻礙了新陳代謝的交換并加重了肝細胞缺氧,這是HSCs激活和纖維化的有力觸發(fā)[16].

毛細血管化的確切機制尚未完全闡明,但已確定了幾種途徑.HSCs和肝細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通過NO依賴和非依賴機制維持LSECs開窗[26],這是可能最廣為人知的機制.參與調(diào)控毛細血管化的信號通路還包括Notch信號通路[27]、Hedgehog (Hh)信號通路[28-30],前者通過調(diào)節(jié)eNOS/sGC和DLL4過表達等促進毛細血管化,后者通過調(diào)節(jié)肝X受體和BMP9等參與毛細血管化[16].

另一方面,毛細血管化的LSECs顯示出其內(nèi)吞能力的顯著下降,影響肝臟對各種脂蛋白的攝取[28],導(dǎo)致高脂蛋白血癥并加重肝臟脂肪變性[31].質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白是內(nèi)皮窗孔形成所需的內(nèi)皮特異性整合膜糖蛋白,其減少能導(dǎo)致LSECs通透性的降低,缺乏質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白的小鼠中LSECs窗孔數(shù)目的顯著減少,從而引發(fā)廣泛的肝脂肪變性[31].毛細血管化的LSECs不僅改變其結(jié)構(gòu),而且改變其自分泌和旁分泌活性,打破其產(chǎn)生血管擴張劑和血管收縮劑的平衡,使之向血管收縮劑的方向轉(zhuǎn)移,降低NO的生成及其生物利用度[32].

2.2 內(nèi)皮功能障礙 內(nèi)皮功能障礙是所有血管床都存在的一種病理狀態(tài),最初被定義為血管對特定刺激的舒張功能受損[33].在肝損傷過程中,LSECs產(chǎn)生的血管擴張劑(如NO、環(huán)氧合酶等)減少、血管收縮劑(如內(nèi)皮素1、血栓素A2等)增加[16].由于NO可能是調(diào)節(jié)肝臟血管張力的最重要的血管擴張劑,因此LSECs內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthase,eNOS)活性降低[34],繼而發(fā)生與血管阻力增加相關(guān)的脂肪變性.Francque等[35]報告了大鼠模型中患有嚴重NAFLD的大鼠門靜脈壓力顯著升高,而門靜脈壓力的增加與嚴重脂肪變性的發(fā)展相一致.而在肝硬化的情況下,除了eNOS活性降低以外,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的增加能促使超氧化物與NO反應(yīng),形成一種強有力的促纖維化劑-過氧亞硝酸鹽,進一步降低NO的利用率[36].

內(nèi)皮功能障礙發(fā)生在NAFLD脂肪變性的早期階段,并在晚期肝硬化中持續(xù)存在[34,37,38].研究人員觀察到喂養(yǎng)高脂飲食6 kw的小鼠肝臟顯示出與炎癥或纖維化無關(guān)的肝血管阻力增加、NO活性降低和氧化應(yīng)激增加,這些變化是在沒有炎癥和纖維化的情況下出現(xiàn)的[38].肝硬化的大鼠肝臟表現(xiàn)出內(nèi)皮功能障礙,表現(xiàn)為對乙酰膽堿的舒張度明顯低于對照組肝臟[39].

LSECs功能的破壞可能在肝臟病理生理中起著重要作用.在NAFLD中,內(nèi)皮功能障礙能導(dǎo)致肝脂肪變性惡化和肝纖維化.實驗證明NO缺失導(dǎo)致肝臟大量脂肪沉積[40]、促進HSCs向促纖維化表型的激活[41].其機理可能與NO通過亞硝基化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和信號傳導(dǎo),抑制脂肪酸生成和脂肪酸有效β氧化等有關(guān)[42].NO的減少也可能在肝纖維化進程中發(fā)揮作用,NO已被證明可以維持HSCs的靜止狀態(tài),減少HSCs暴露于NO的時間可促進其激活[41].向共培養(yǎng)的LSECs和HSCs中加入eNOS抑制劑L-NAME也能抑制LSECs維持HSCs靜止的能力[43].

在藥物的治療上,一種肝選擇性NO供體,V-PYRRO/NO能改善NAFLD小鼠模型的肝脂肪變性和餐后葡萄糖耐量[44].他汀類藥物降低門靜脈壓力的有益效果已經(jīng)在肝硬化患者中得到證實[45],其潛在分子機制可能與上調(diào)肝內(nèi)皮KLF2衍生的轉(zhuǎn)錄程序提供血管保護有關(guān),如誘導(dǎo)eNOS和血栓調(diào)節(jié)素生成.

2.3 血管生成 血管生成,是指從先前存在的血管床形成新生血管的過程[46],毛細血管化與慢性炎癥一起促進血管生成,窗孔的喪失致使缺氧的出現(xiàn),誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF)積累,從而刺激周圍細胞產(chǎn)生血管生成因子,啟動新血管形成[46-48].在對氧化應(yīng)激的反應(yīng)中,LSECs本身也可以通過直接分泌VEGF、TNF-α、血管生成素2(angiopoietin-2,Ang-2)和各種類型的Wnt配體及Frizzled(Fz)家族受體來促進血管生成[16].

與血管生成相關(guān)的分子事件始于簡單脂肪變性,但實質(zhì)性的血管生成開始于在NASH階段[7].肝臟單純脂肪變性患者和經(jīng)活檢證實的NASH患者的血清Ang-2水平高于健康人[49].在NASH動物模型中,不僅VEGF和CD105的表達增加,還能觀察到肝臟正常血管系統(tǒng)被破壞[50].

血管生成的觸發(fā)因素包括脂質(zhì)堆積、脂肪毒性、炎癥、組織缺氧等[50].血管生成是多種促血管生成介質(zhì)和效應(yīng)細胞相互作用的結(jié)果,涉及許多信號通路,例如VEGF和VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR),Ang2和Tie2受體等.VEGF可刺激內(nèi)皮細胞增殖并誘導(dǎo)升高微血管通透性,從肝脂肪變性到NASH的過渡過程中VEGF水平上升,而抗血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)治療可阻斷VEGF,改善肝臟血管系統(tǒng)[50].而貝伐單抗是一種適合用作血管 生成直接抑制劑的治療候選藥物,其抗血管生成的功效歸因于其結(jié)合VEGF-A的能力[51]. 血管生成素(主要是ANG1和ANG2)通過Tie受體傳導(dǎo)信號來調(diào)節(jié)正常的血管生成,在炎癥介質(zhì)的環(huán)境中,ANG2成為主要的血管生成信號,抑制Tie2發(fā)出維持血管穩(wěn)態(tài)的ANG1信號,促進新生血管生成,形成異常的血管系統(tǒng)[52].在藥物治療上,使用L1-10能抑制ANG2信號通路,從而降低血管密度,使微血管網(wǎng)絡(luò)部分正常化[49].

2.4 促炎功能 雖然在NAFLD的初始階段LSECs發(fā)揮了抗炎作用,但隨著NAFLD的發(fā)展,LSECs逐漸獲得促炎表型和促炎功能.在有損傷刺激的情況下,LSECs分泌大量的細胞因子和趨化因子(如TNF-α,IL-6,IL-1和CCL2)激活KCs[16].KCs在肝竇毛細血管化后被激活,進而推動慢性肝損傷的發(fā)展[21].在簡單脂肪變性階段,就能發(fā)現(xiàn)參與KCs激活的炎癥細胞因子、趨化因子(如TNF-α、IL-6和MCP-1)上調(diào)[21].損傷的肝細胞和炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì),能夠進一步激活LSECs炎癥介質(zhì),使炎癥反應(yīng)持續(xù)[53].LSECs逐漸失去其生理屏障能力,上調(diào)細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和VAP-1,招募白細胞,導(dǎo)致循環(huán)白細胞進入肝實質(zhì).經(jīng)過以上過程,LSECs從耐受性介質(zhì)轉(zhuǎn)化為強大的免疫刺激劑,成為肝內(nèi)炎癥的重要組成部分[16].

在減輕肝臟炎癥的治療上,研究發(fā)現(xiàn)使用抗VLA-4抗體抑制VCAM-1配體VLA-4對單核細胞的作用,可抑制單核細胞在肥胖小鼠的LSECs間的粘附和跨內(nèi)皮遷移[54].

2.5 促纖維化功能 肝纖維化是肝實質(zhì)中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積的結(jié)果,由肝細胞損傷和炎癥引起和HSCs激活介導(dǎo).如前所述,LSECs毛細血管化、內(nèi)皮功能障礙會促進纖維化的發(fā)展.質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白缺失的小鼠顯示出LSECs窗孔數(shù)量的明顯減少,接著會自發(fā)發(fā)展為竇周肝纖維化[31].將LSECs和HSCs共同培養(yǎng)的實驗證明健康的LSECs具有保持HSCs靜止的能力,而在培養(yǎng)環(huán)境中加入eNOS抑制劑可阻斷該能力[41].血管生成也與纖維化聯(lián)系密切.敲除血管生成抑制劑脯氨酰羥化酶-2(prolyl hydroxylase-2,PHD2)基因可導(dǎo)致肝纖維化[55].另一方面,阻斷血管生成對纖維化消退的作用尚存在爭議.替米沙坦等血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers,ARBs)已被證明可通過抑制血管生成減輕NASH中的肝纖維化[56].在體內(nèi)對整聯(lián)素Avβ3的特異性抑制可減少血管生成,卻會使肝纖維化惡化.因此血管生成和肝纖維化之間的關(guān)系還需要進一步探討.

肝損傷后,LSECs獲得親纖維化表型,直接分泌ECM參與纖維化,分泌促纖維化分子間接調(diào)節(jié)肝微環(huán)境.它們的直接作用是在持續(xù)損傷后響應(yīng)TGF-β1而合成層粘連蛋白和膠原蛋白[57].內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelialto-mesenchymal transition,EndMT),即內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞并促進細胞外基質(zhì)沉積,可能是NASH纖維化的一個研究領(lǐng)域.已有研究描述了酒精或丙型肝炎病毒相關(guān)肝硬化患者以及四氯化碳治療的小鼠的內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[58],但對NAFLD中這方面的研究尚有空缺,值得進一步探索.

LSECs主要通過改變血管擴張劑/血管收縮分子的平衡來調(diào)節(jié)HSCs的活化.在肝臟簡單脂肪變性階段,參與HSCs激活和影響纖維化的因子(如αSMA,TIMP1,IL-1β)以及VEGFR-2的mRNA表達增加[21].在NASH中LSECs過表達的VAP1也直接參與HSCs的活化[59].在喂食蛋氨酸和膽堿缺乏飲食或高脂肪飲食的小鼠中,抑制VAP1可減輕肝纖維化[59].外泌體是將特定內(nèi)容物遞送至靶細胞來促進細胞間通訊的細胞外囊泡.研究表明,來自功能失調(diào)的LSECs的外泌體調(diào)節(jié)HSCs的激活和遷移,有利于纖維生成[60].需要進一步的研究來真正理解外泌體和其在纖維化過程中的作用.

3 結(jié)論

生理狀態(tài)下,LSECs是維持肝臟穩(wěn)態(tài)的守門人,富有可開合的窗孔為其獨特的結(jié)構(gòu)特征,在功能上LSECs主要表現(xiàn)出強內(nèi)吞作用和促血管舒張、抗炎和抗纖維化作用,并能通過旁分泌作用協(xié)調(diào)肝再生.在NAFLD中,LSECs會迅速對損傷做出反應(yīng),最早最顯著的形態(tài)學改變?yōu)槊氀芑?內(nèi)皮功能障礙發(fā)生于脂肪變性的早期階段,并在晚期肝硬化持續(xù)存在.在NASH階段,LSECs有助于肝血管生成、炎癥、纖維化,事實上,與以上現(xiàn)象相關(guān)的分子事件也出現(xiàn)于早期脂肪變性階段.這些現(xiàn)象又相互關(guān)聯(lián),如血管生成與纖維化關(guān)系密切,但具體機制還需要進一步探討.反過來LSECs的病理變化又能推動NAFLD的進展與惡化.目前已有多種治療策略針對治療功能失調(diào)的LSECs,比如通過抑制Notch或Hh恢復(fù)開窗,通過抗ANG-2、中和VEGF-A或抗VEGFR2抑制血管生成,通過阻斷VLA-4恢復(fù)抗炎能力等,需要進一步明確LSECs功能變化的機制,為LSECs成為治療NAFLD新靶點提供依據(jù),并為肝臟疾病的臨床診斷和治療提供新的方向.