棉粕對鹽堿脅迫下滴灌棉田微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

常豆豆，王開勇，孟春梅，安夢潔，洪大雙

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

鹽堿土是受自然成土因素和人類生產(chǎn)活動因素共同作用、相互影響下形成的不同鹽化和堿化土壤的總稱[1]。鹽堿土有較高的滲透壓，使得植物無法正常吸收土壤水分，甚至失水死亡，并且含有危害植物生長的物質(zhì)，因此嚴重抑制了植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)。新疆具有特殊的氣候類型，其特點為降水少、蒸發(fā)量大，滴灌技術(shù)可以有效提高水分利用率，并減少土壤板結(jié)[2]。據(jù)調(diào)查得出，新疆灌區(qū)耕地總面積占全國灌區(qū)耕地總面積的1/3，是我國重要的棉花產(chǎn)地之一。隨著社會飛速發(fā)展，土壤生態(tài)環(huán)境日益惡化，現(xiàn)有的土壤資源鹽堿化、土壤板結(jié)等問題越來越突出[3]，改良鹽堿土成為解決以上問題的有效途徑。

土壤鹽漬化改良中技術(shù)手段主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法3種[2]，其中，生物方法克服了物理方法高成本和化學(xué)方法污染土壤環(huán)境等缺點，從經(jīng)濟和生態(tài)循環(huán)方面起到促進作用，而成為當(dāng)今應(yīng)用前景最好的鹽堿土改良措施。目前，多種腐殖酸型土壤調(diào)理劑[4]、生物有機肥[5]和生物炭[6]等進入市場，通過促進土壤微生物大量繁殖達到了改變微生物群落結(jié)構(gòu)的效果，進一步改良了土壤和提高了作物產(chǎn)量。此外，粕類也是年一種新型生物改良劑，主要包括棉粕、葵粕等[7]。新疆是中國的棉花生產(chǎn)大省，隨著棉花產(chǎn)量的增加，棉粕的產(chǎn)量也越來越大。棉粕作為一種新型土壤改良劑，可以達到改善土壤結(jié)構(gòu)，進一步改善土壤中微生物活性，改變其群落結(jié)構(gòu)的目的，從而使鹽堿土被改造為養(yǎng)分充足，結(jié)構(gòu)適宜的灌溉耕地[8]。

特定環(huán)境條件下存在著對應(yīng)的微生物群落,動、植物不適宜在很多極端土壤環(huán)境生存，例如鹽堿土，但其存在著一定數(shù)量的微生物群落，具有耐鹽堿、嗜鹽堿的特性[9]；這些微生物的生命活動受土壤極端理化性質(zhì)的影響，從而形成適應(yīng)高鹽堿環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)[10]。微生物群落是否穩(wěn)定和土壤有機質(zhì)的活性高低都可以由土壤微生物多樣性來表示，其對植物的生長發(fā)育和群落結(jié)構(gòu)的演替具有重要作用[11]。添加生物改良劑會使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如水稻施用生物有機肥后，土壤細菌中放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、變形菌門等門相對豐度增加[12]；添加生物碳可提高鹽堿土中硝化螺旋菌門和芽孢桿菌門的相對豐度，同時降低土壤pH，使土壤系統(tǒng)功能發(fā)生改變，有利于鹽堿土壤的改良[13]，但是施用效果在不同土壤環(huán)境下有差異。目前對鹽堿土生物改良研究較多，但棉粕施用量的配比尚未明確，不同施用量的棉粕對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是否有影響也不清楚。

本文采用高通量測序技術(shù)[14]分析鹽堿脅迫處理下滴灌棉田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的情況，探究棉粕對滴灌鹽堿脅迫土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，從而為棉粕在改良新疆鹽堿化滴灌棉田的施用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

新疆石河子市地處天山北麓中段，準噶爾盆地南部，地理坐標位于E84′58″～86′24″，N 43′26″～45′20″。本研究田間試驗于2017年在石河子大學(xué)試驗站進行，2016年種植作物為棉花，基本土壤理化指標pH為7.73，電導(dǎo)率(1∶2.5)為280 μs/cm，全氮為0.5 g/kg，有機碳為16.19 g/kg。棉花品種為新陸早60號(Gossypium hirsutumcv.Xinluzao 60)，試驗田所用肥料為棉粕與復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=20∶15∶9)配施。

1.2 試驗設(shè)計

以早熟陸地棉品種新陸早60號為試材，在2016年用NaCl和Na2CO3分別對試驗小區(qū)土壤進行鹽化、堿化，直至小區(qū)土壤達到設(shè)定的含鹽量8 g/kg。于當(dāng)年4月初將棉粕定量的均勻撒入小區(qū)，為了棉粕充分進入土壤，在原地進行淺翻(深度為0～20 cm)，使棉粕在土壤中提前腐熟。試驗小區(qū)面積5 m2，小區(qū)間距1.4 m，每個處理重復(fù)3次，共18個小區(qū)。

試驗鹽脅迫處理Y0為NaCl+0 kg/hm2棉粕，Y1為NaCl+3 000 kg/hm2棉粕，Y2為NaCl+6 000 kg/hm2棉粕；堿脅迫處理J0為Na2CO3+0 kg/hm2棉粕，J1為Na2CO3+3 000 kg/hm2棉粕，J2為Na2CO3+6 000 kg/hm2棉粕。

試驗采用滴灌模式，一膜三管六行，寬窄行處理，寬行距50 cm,窄行距30 cm。全生育期滴灌量4 200 m3/hm2;其它常規(guī)管理措施同當(dāng)?shù)卮筇镆恢?10月收獲。

1.3 樣品采集

在棉花收獲期于各個小區(qū)依次進行采樣。每個小區(qū)采集深度為0～20 cm的三鉆土樣，混合均勻后分成2份土樣，一份室內(nèi)風(fēng)干用于后期土壤理化性質(zhì)的測定，另一份放于滅菌密封袋，置于-20 °C后期進行微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析。

1.4 指標測定方法

(1)土壤微生物多樣性。取0.5 g土壤試驗樣品提取DNA,將獲得的土壤DNA樣品保存于-20 °C冰箱中用于后期高通量測序，其16S引物擴增區(qū)間為V3+V4區(qū)(F:5′-ARACTYCTACGGRAGGCWG-3′;R:5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′),其后續(xù)測序委托給北京百邁客生物科技有限公司完成相關(guān)測序。

(2)對風(fēng)干及過篩后土壤樣品進行pH、電導(dǎo)率(土壤:水=1∶2.5)、有機質(zhì)、總氮理化性質(zhì)分析。pH 和電導(dǎo)率使用pH儀和電導(dǎo)率儀測定，土壤全氮用凱氏定氮法，有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定。每個樣品3個重復(fù),取其平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用 Microsoft Excel 2010和Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理及作圖；采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕對鹽、堿脅迫下灌溉棉田pH和EC的影響

棉花收獲期不同處理灌溉棉田的土壤pH、EC分別如圖1所示。由圖1可見：各處理間土壤pH在 7.5 以上，均呈堿性。在鹽脅迫處理下，隨著棉粕施用量的增加，Y1與Y0處理相比，pH值下降1.02%，EC下降28.77%；相反，Y2處理較Y0的pH值高2.07%，EC低7.29%。在堿脅迫處理下，與J0處理相比，J1處理的pH值高4.04%(P<0.05)，J2處理pH值增加2.38%，J1和J2處理的土壤電導(dǎo)率分別增加57.74%和10.25%。

圖1 不同處理對滴灌棉田pH(a)和EC(b)的影響

2.2 棉粕對鹽、堿脅迫下灌溉棉田全氮和有機碳的影響

棉粕對鹽、堿脅迫下滴灌棉田的土壤全氮和有機碳影響的結(jié)果(圖2)顯示：

圖2 不同處理對鹽、堿脅迫下滴灌棉田全氮和有機碳的影響

(1)在鹽脅迫處理下，添加棉粕后土壤全氮的積累量均顯著增加，Y1處理較Y0處理增加7.79%(P<0.05)，Y2處理較Y0處理增加3.90%。在堿脅迫處理下，與J0相比，添加棉粕后土壤全氮的積累量變化有所波動，J1處理增加2.67%，而J2處理下降4.17%。

(2)在鹽脅迫處理下，添加棉粕后土壤有機碳的積累量降低；與Y0處理相比，Y2處理并沒有發(fā)生顯著性變化，Y1處理減少5.14%(P<0.05)。在堿脅迫處理下，與J0處理相比，添加棉粕后處于顯著降低趨勢，J1、J2處理分別降低17.13%、12.82%。

2.3 土壤生物信息學(xué)分析

2.3.1 OTU聚類分析

將6個樣品進行OTU聚類分析，結(jié)果(圖3)顯示：鹽、堿脅迫處理下共有的OUT為1 161個，Y0處理下特有的OUT為101個，Y1處理下有119個特有的OUT,Y2處理下特有的OUT有112個。堿脅迫處理下，J0下特有的OUT為94個，J1處理下有89個特有的OUT，J2處理下特有的OUT為83個?？梢姴煌幚硐峦寥乐蠴UT數(shù)為Y1>Y2>Y0>J0>J1>J2,說明鹽脅迫處理的土壤微生物類群比堿脅迫處理的土壤微生物類群豐富，在Y1處理下土壤微生物類群最豐富，而且在不同處理下有部分一致的微生物類群，但整體上差異較明顯。

圖3 土壤樣品微生物OTU數(shù)量的韋恩圖

2.3.2 棉粕對鹽、堿脅迫下土壤細菌群落組成影響

基于 OTU 結(jié)果用不同顏色變化表示不同樣品在門水平上的群落組成相似性，土壤樣品通過高通量測序后先后共獲得11個門和不確定類群，結(jié)果見圖4。由圖4可見：

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

(1)11個門分別屬于古菌域的變形菌門(Proteobacteria)芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。施加棉粕后，鹽、堿脅迫處理后土壤中占優(yōu)勢的菌門有變形菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門和放線菌門。

(2)放線菌門和芽單胞菌門在添加棉粕處理后較高，總體來說，添加棉粕使得鹽、堿脅迫處理后土壤中變形菌門(Proteobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)數(shù)量增多，使酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的數(shù)量減少，但各處理間相對豐度無顯著性差異。

2.3.3 群落結(jié)構(gòu)物種差異性分析

為了研究樣品間微生物群落豐度的差異，篩選的不同處理下兩個類群前10個物種進行組間差異性分析，結(jié)果(圖5)顯示：在鹽、堿脅迫處理下，前10個物種不盡相同，施加棉粕后土壤中的各物種較空白有顯著差異。

由圖5a可知，棉粕處理(Y1，Y2)顯著降低放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和Latescibacteria的細菌相對豐度(P<0.05)，同時顯著增加綠菌門(Chlorobi)和藍藻細菌(Cyanobacteria)的相對豐度(P<0.05)。Y1處理能顯著增加廣古菌門(Euryarchaeota)的豐度(P<0.05)，Y2處理顯著增加裝甲菌門(Armatimonadetes)的豐度(P<0.05)。

由圖5b可以看出：施加棉粕后變形菌門(Euryarchaeota)未發(fā)生顯著性變化，擬桿菌門(Bacteroidetes)在J1處理下與未施加棉粕相比呈現(xiàn)顯著性增加。衣原體門(Chlamydiae)在J2處理下顯著性增加，其余微生物菌門在施加棉粕后都呈現(xiàn)顯著性變化(P<0.05)。

圖5 群落結(jié)構(gòu)物種差異性分析

2.4 土壤環(huán)境因子RDA分析

為了更清楚地了解土壤各環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)影響情況，分別對鹽堿脅迫下灌溉棉田的微生物群落與環(huán)境因子進行RDA分析,結(jié)果如圖6所示。

圖6 土壤環(huán)境因子RDA排序圖

由圖6可知：土壤環(huán)境因子pH、EC、TN和有機碳SOC對鹽、堿脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同。4種環(huán)境因子對鹽脅迫處理下土壤微生物群落總解釋率為72.18%，堿脅迫處理下為73.14%。堿脅迫處理下PC1和PC2分別為0.532 4和0.199 0，占總特征值的73.14%，這說明排序軸的土壤環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)較高，解釋了環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)總方差的73.14%。整體來看，鹽堿土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的RDA排序效果均較好。

鹽脅迫處理下RDA排序圖(6a)顯示：土壤的pH、電導(dǎo)率和有機質(zhì)之間呈正相關(guān)，三者共同作用促使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與三者土壤全氮呈負相關(guān)。土壤的pH、電導(dǎo)率和有機質(zhì)積累越多，對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大。

堿脅迫處理下RDA排序圖(圖6b)顯示：土壤的pH、電導(dǎo)率和與全氮呈正相關(guān)，與有機質(zhì)呈負相關(guān)，且電導(dǎo)率對堿土微生物群落的影響最大，電導(dǎo)率越大，對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也越大。

3 討論

(1)土壤中鹽分隨著水分運動，因此水分運移必定會對土壤pH和EC產(chǎn)生影響，土壤pH和EC都直接或者間接影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。李新[15]等通過研究不同鹽堿程度下土壤微生物得出，隨著土壤電導(dǎo)率(EC)升高，鹽堿土壤結(jié)構(gòu)松散程度逐漸加劇，而土壤穩(wěn)定性變差不利于微生物的生存；陜紅[16]在研究有機物料對鹽堿度影響時發(fā)現(xiàn)，同一種有機物質(zhì)施入到不同種類的土壤對pH和EC的影響程度不一樣，當(dāng)棉粕施入鹽、堿化土壤中,堿化土壤pH比鹽化的高很多，棉粕施入鹽堿化土壤后對其pH影響作用也不相同；總體上添加棉粕后土壤pH影響有波動，但是影響不顯著。在一定程度上添加棉粕可以降低pH，鹽化土壤pH降低的幅度大于堿化土壤的，添加棉粕會使堿化土壤pH略微增加，但是棉粕對土壤pH的影響往往小于鹽堿本身對土壤pH的影響。土壤pH值是土壤肥力和酸堿度的重要指標，pH越低，微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。鄧欣等[17]研究表明土壤全氮和有機質(zhì)是土壤微生物生命活動的能量來源。土壤有機質(zhì)積累量越大，微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富[18]。本研究結(jié)果表明，隨著土壤鹽、堿脅迫程度的加劇，土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)也在發(fā)生改變；經(jīng)過RDA分析表明，鹽脅迫處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土壤的pH、電導(dǎo)率和全氮關(guān)系密切，土壤全氮積累量越多，對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大；而堿脅迫處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土壤pH、電導(dǎo)率和與有機碳關(guān)系密切，堿脅迫處理后土壤微生物群落變化與土壤有機碳的積累量相關(guān)，有機碳積累量越低，J2處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化越大，說明不同鹽、堿程度下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別。

(2)微生物種類、數(shù)量及代謝活動狀況有利于改善土壤結(jié)構(gòu)，促進良好土壤環(huán)境的形成[3]；本研究表明，棉粕作為有機質(zhì)施入鹽、堿脅迫處理土壤中，為微生物提供了生存物質(zhì)。土壤中微生物種群的數(shù)量及種類都非常龐大，王薇琦等[19]在研究干旱區(qū)不同類型土壤細菌群落時發(fā)現(xiàn)，碳酸鹽型土壤菌群主要包括10個門類，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，本研究表明所得序列被歸為11個門，鹽堿脅迫處理下占優(yōu)勢的菌門有變形菌門、放線菌門和芽單胞菌門，優(yōu)勢菌門是變形菌門，其中疣微菌門和厚壁菌門所占比例較小，說明鹽堿土壤處于不同地域和類型，優(yōu)勢種群和構(gòu)成的群落結(jié)構(gòu)也并不完全相同，這與文獻[1]研究結(jié)果一致。加入棉粕后可使鹽堿土壤衍生出較多的微生物種群，出現(xiàn)本研究中這種比例上差異的原因可能是由于棉粕的施用使土壤有機質(zhì)含量增加，從而微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。趙婉雨等[20]對達布遜鹽湖微生物的研究得出優(yōu)勢菌門為變形菌門和疣微菌門，牛世全等[21]研究發(fā)現(xiàn)河西走廊原生鹽堿土和農(nóng)田土中的優(yōu)勢菌門為變形菌門，本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌與之一致，這說明在鹽堿土壤環(huán)境下微生物群落分布具有相似性，且放線菌門與變形菌門是鹽堿土中最普遍的2種。另外，本研究發(fā)現(xiàn)施用棉粕后土壤中變形菌門和芽單胞菌門數(shù)量增加，這可能是因為變形菌門和芽單胞菌門中的細菌群體更偏好利用棉粕，從而促進群體增加，而酸桿菌門和放線菌門數(shù)量減少是因為其不能很好的利用棉粕；堿脅迫處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于鹽脅迫處理，可能是因為高pH對微生物有更大的毒害作用。

(3)應(yīng)用土壤改良劑是修復(fù)鹽堿土壤的重要措施之一。近年來，在土壤改良劑的篩選方面展開了大量工作。劉玉國等[22]以31種物質(zhì)進行鹽漬化土壤改良劑的篩選，通過對改良劑改良后土壤pH值和EC的測定發(fā)現(xiàn)，葵粕、棉粕和檸檬酸改良鹽堿化土壤效果更顯著。通過微生物發(fā)酵棉粕產(chǎn)生的腐植酸制成肥料，所形成的腐植酸肥料有改良土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥效、增加作物產(chǎn)量等功效[23]。王凡等[24]施用生物炭改良鹽堿土土壤時發(fā)現(xiàn)，少量的生物炭能夠使新疆鹽堿土壤的pH值和含鹽量增加，能有效提高土壤有機質(zhì)的含量，全氮的積累量也有所增加。本研究結(jié)果中，經(jīng)棉粕處理后土壤的pH值與電導(dǎo)率(EC)的變化與上述研究一致，在鹽脅迫處理下呈下降趨勢，在堿脅迫處理下呈上升趨勢，其pH值降低可能是由于土壤灌溉和淋濾作用增加，土壤中鹽分離子隨著水分向下運移；相反，滴灌棉田的土壤EC增加可能是由于表層土壤的蒸發(fā)作用較強，使土壤下層積累的鹽分隨著水向表層土壤移動，水分蒸發(fā)后使得鹽停留在土壤表層，從而出現(xiàn)土壤表層的電導(dǎo)率增大的現(xiàn)象[25]，而且棉粕施入土壤后被降解成養(yǎng)分，同時會釋放導(dǎo)電離子，也可能導(dǎo)致EC增大；鹽、堿脅迫處理土壤中施入棉粕后，棉粕的加入激發(fā)了土壤中的有機碳和全氮，鹽脅迫土壤中碳氮含量及儲量高于堿脅迫土壤，可能原因是與鹽土和堿土本身性質(zhì)有關(guān)。

在鹽脅迫土壤中全氮含量隨著棉粕的施入而增加，說明土壤的有機碳呈現(xiàn)下降趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于土壤微生物通過分解棉粕使土壤中的有機碳含量發(fā)生變化，隨著生育期的推后，土壤中微生物對棉粕的分解量減少，使得收獲期時殘留在土壤中的有機質(zhì)含量較少[26]。袁穎紅等[27]研究表明在鹽堿土中施加生物炭能顯著增加微生物量，本研究表明施用不同梯度的棉粕后土壤中微生物數(shù)量增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相較未施加棉粕的豐富，優(yōu)勢種豐度未顯著增加。

4 結(jié)論

(1)鹽、堿脅迫處理后其優(yōu)勢菌門是變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門，其中變形菌門比例在鹽、堿脅迫處理下最大分別可達到34.81%和34.18%。施用棉粕后各處理間土壤微生物群落組成無明顯差異，施加棉粕土壤中優(yōu)勢種群的相對豐度。

(2)棉粕對于緩解鹽、堿脅迫有積極作用，當(dāng)棉粕添加量在3 000 kg/hm2時，土壤中pH顯著下降。鹽脅迫處理下滴灌棉田pH值和全氮的積累量增加，土壤電導(dǎo)率和有機碳的積累降低；堿脅迫處理下效果不明顯，土壤的pH和電導(dǎo)率都有所增加，全氮積累量降低。施用少量棉粕對鹽脅迫處理土壤修復(fù)效果較好，施用大量棉粕對堿土修復(fù)效果較好。

(3)在鹽脅迫處理下，土壤全氮和電導(dǎo)率是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子；堿脅迫處理下土壤pH，電導(dǎo)率和土壤全氮是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子。