膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素耐藥基因的初步研究

王怡婷 鄭惠文 趙冰 夏輝 王勝芬 歐喜超 周楊 宋媛媛 鄭揚(yáng) 趙雁林 申阿東

膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)是一種快速生長(zhǎng)的對(duì)多種藥物具有先天性耐藥的非結(jié)核分枝桿菌，可引起80%的快生長(zhǎng)分枝桿菌肺部感染[1]。克拉霉素是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的核心藥物，也是治療膿腫分枝桿菌感染的基石，但近期發(fā)現(xiàn)膿腫分枝桿菌對(duì)其耐藥率呈上升趨勢(shì)。盡管既往已有膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥機(jī)制研究[2-3]，但由于膿腫分枝桿菌存在不同的亞種、不同的基因型，其對(duì)克拉霉素的耐藥機(jī)制也不盡相同[4-6]。為進(jìn)一步正確指導(dǎo)臨床選用克拉霉素，筆者對(duì)膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的耐藥特征進(jìn)行初步分析，為有效控制其耐藥提供新思路。

材料和方法

1.菌株來(lái)源：選取中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室保存的2016—2017年全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)菌株中，鑒定為膿腫分枝桿菌復(fù)合群的385株臨床分離株作為研究對(duì)象。標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 19977和CR 5701均來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。質(zhì)控菌株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。研究方案獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審批(2020-k-158)。

2.菌種鑒定和耐藥基因分析：采用多靶位基因測(cè)序法。(1)菌種鑒定：將凍存于-80 ℃的菌株全部復(fù)蘇后接種于改良羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取菌株DNA。根據(jù)文獻(xiàn)合成16S rRNA[7]、rpoB[8]、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)[8]、hsp65[9]。先采用16S rRNA對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，若鑒定為膿腫分枝桿菌復(fù)合群則采用另3種靶基因進(jìn)行鑒定，當(dāng)3種結(jié)果均不一致時(shí)，排除該菌種診斷，當(dāng)其中2種靶基因結(jié)果一致時(shí)則可確定為該菌種。(2)耐藥基因檢測(cè)：根據(jù)文獻(xiàn)合成erm(41)[5,10]、rrl[10]和rrs[11]基因特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。20 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Taq MasterMix 10 μl,上下游引物各0.4 μl(10 μmol),1.4 μl模板液，雙蒸水7.8 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。引物的合成、擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，以及基因測(cè)序均由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。最后將測(cè)序得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 膿腫分枝桿菌復(fù)合群菌株耐藥基因擴(kuò)增引物序列

3.藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)：采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微孔板稀釋法對(duì)克拉霉素、阿米卡星、阿奇霉素、頭孢西汀、亞胺培南、美羅培南、利奈唑胺、替加環(huán)素、莫西沙星、加替沙星、米諾環(huán)素、利福布汀、妥布霉素、左氧氟沙星等14種抗結(jié)核藥品進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[12]；藥品的藥敏臨界值參照CLSI M24-A3指南[12]標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該指南中沒(méi)有藥敏臨界值的藥品，按以下原則參照：左氧氟沙星和加替沙星參考莫西沙星的藥敏臨界值，米諾環(huán)素和利福布汀參考堪薩斯分枝桿菌的藥敏臨界值，阿奇霉素參考文獻(xiàn)[13]，替加環(huán)素參考文獻(xiàn)[14]。

具體操作如下：刮取改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基上處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的膿腫分枝桿菌復(fù)合群菌株，將菌懸液配成0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛群?，?0 μl加入到10 ml陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯培養(yǎng)基中，以使最終接種液濃度約為7.5×105CFU/ml，顛倒混勻。分別將不同藥品加入到含有100 μl的陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯培養(yǎng)基96孔板的第1列，倍比稀釋后加入100 μl稀釋后的菌液，最后1列為不含藥液的陽(yáng)性對(duì)照，24 h后在無(wú)藥培養(yǎng)基孔中加入70 μl指示劑，孵育24 h后如培養(yǎng)基為紅色，則在所有含藥培養(yǎng)基中加入指示劑，觀察3 d 時(shí)菌株的生長(zhǎng)情況，記錄該藥品對(duì)膿腫分枝桿菌復(fù)合群的最低抑菌濃度(MIC)。又因膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的耐藥有2種類(lèi)型，故對(duì)其分別觀察3、7、14 d的生長(zhǎng)情況，并將3 d時(shí)即出現(xiàn)耐藥的菌株判定為獲得性耐藥，將3 d時(shí)為敏感、14 d時(shí)為耐藥的菌株判定為誘導(dǎo)耐藥菌株(菌株數(shù)=14 d時(shí)的耐藥菌株-3 d時(shí)的耐藥菌株)[5,10,12]。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 16.3軟件對(duì)研究菌株的耐藥情況進(jìn)行描述性分析。

結(jié) 果

1.膿腫分枝桿菌復(fù)合群亞種和耐藥譜：385株膿腫分枝桿菌復(fù)合群菌株中，218株為膿腫分枝桿菌[包括185株為erm(41)T28基因型和33株erm(41)C28基因型]，163株為馬賽分枝桿菌，4株為博萊分枝桿菌(數(shù)據(jù)少，代表性低，不納入分析)。且阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素3種藥品對(duì)膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌的殺菌活性最強(qiáng)，見(jiàn)表2。

表2 14種抗結(jié)核藥品對(duì)膿腫分枝桿菌復(fù)合群的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的耐藥特點(diǎn)： 31株為克拉霉素獲得性耐藥，其中，11株為erm(41)T28基因型，3株為erm(41)C28基因型，17株為馬賽分枝桿菌；173株為誘導(dǎo)耐藥株，其中，171株(98.8%)為erm(41)T28基因型，2株(1.2%)為馬賽分枝桿菌，見(jiàn)表3。

表3 膿腫分枝桿菌復(fù)合群在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)克拉霉素的耐藥情況

3.膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素和阿米卡星的耐藥突變特點(diǎn)：在31株克拉霉素獲得性耐藥菌株中，10株膿腫分枝桿菌[包括7株erm(41)T28基因型和3株erm(41)C28基因型]及10株馬賽分枝桿菌均在rrl基因的2058/2059位點(diǎn)突變，最常見(jiàn)突變類(lèi)型分別為A2058C和A2058G。13株對(duì)阿米卡星耐藥的菌株中，有9株[包括5株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株馬賽分枝桿菌]在rrs基因的A1408G位點(diǎn)發(fā)生突變，其中7株同時(shí)對(duì)克拉霉素耐藥[包括3株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株馬賽分枝桿菌]。具體見(jiàn)表4。

表4 31株克拉霉素獲得性耐藥的膿腫分枝桿菌復(fù)合群菌株rrl和rrs基因耐藥突變情況

討 論

膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥機(jī)制包括獲得性耐藥和誘導(dǎo)性耐藥，前者可與23S rRNA的rrl基因2058或2059位點(diǎn)突變有關(guān)，后者則與被克拉霉素誘導(dǎo)表達(dá)的編碼紅霉素核糖體甲基化酶的erm(41)基因有關(guān)。其中，有活性的erm(41)基因能催化23S rRNA的rrl基因2058或2059位點(diǎn)上的腺嘌呤甲基化而產(chǎn)生耐藥[3]。馬賽分枝桿菌是膿腫分枝桿菌的一個(gè)亞種，其erm(41)基因的274 bp缺失，可導(dǎo)致erm(41)基因失活。此外，基于erm(41)基因的第28位堿基存在多態(tài)性，其對(duì)克拉霉素可產(chǎn)生不同的耐藥，如erm(41)T28基因型能夠產(chǎn)生有活性的erm蛋白，可能與克拉霉素誘導(dǎo)性耐藥有關(guān)；而erm(41)C28基因型則對(duì)克拉霉素敏感[4-6]。本研究耐藥檢測(cè)顯示，erm(41)T28基因型的耐藥率由培養(yǎng)3 d時(shí)的5.9%上升至培養(yǎng)14 d時(shí)的98.4%，而erm(41)C28基因型的耐藥率則未發(fā)生變化，提示erm(41)T28基因型發(fā)生了誘導(dǎo)性耐藥。又因erm(41)基因只與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物(如克拉霉素)和氨基糖苷類(lèi)藥物(替代藥物，如阿米卡星)的耐藥具有相關(guān)性，本研究?jī)H對(duì)這兩種藥品的耐藥性進(jìn)行分析。

克拉霉素是治療膿腫分枝桿菌的核心藥品。治療失敗的主要原因是誘導(dǎo)性耐藥的產(chǎn)生。在膿腫分枝桿菌復(fù)合群中，與誘導(dǎo)性耐藥相關(guān)的erm(41)基因在不同菌種或基因型中存在明顯差異[4-6]，表明erm(41)基因的正確測(cè)序，以及分析膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的耐藥特征，對(duì)于預(yù)測(cè)治療結(jié)果至關(guān)重要。

通過(guò)分析膿腫分枝桿菌復(fù)合群對(duì)不同藥品的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素對(duì)膿腫分枝桿菌的殺菌活性最強(qiáng)，并且阿米卡星的殺菌活性高于克拉霉素，這與之前研究結(jié)果一致[15]，然而，阿米卡星需要長(zhǎng)期進(jìn)行肌內(nèi)注射或靜脈注射，限制了其在臨床中的應(yīng)用，但隨著阿米卡星脂質(zhì)體吸入懸浮液的出現(xiàn)，這種情形大大改善[16]，提示阿米卡星作為治療膿腫分枝桿菌復(fù)合群的理想替代藥品將成為現(xiàn)實(shí)。膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素的獲得性耐藥率為8.1%，與法國(guó)的一項(xiàng)研究結(jié)果(9.09%)相近[17]，但低于我國(guó)(33.95%)[13]和韓國(guó)(15.84%)[18]的報(bào)道，高于巴西報(bào)道的5.55%[19]，這可能與不同研究中分離株的來(lái)源不同或患者治療病史差異有關(guān)。

通過(guò)分析不同亞型膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素和阿米卡星的耐藥特點(diǎn)，筆者發(fā)現(xiàn)erm(41)T28基因型膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素的誘導(dǎo)性耐藥率為98.8%，高于之前56.3%的報(bào)道結(jié)果[20]，推測(cè)這些分離株可能既往接觸過(guò)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物如克拉霉素的治療，因此，在治療時(shí)不宜選擇克拉霉素。另外，已有研究表明馬賽分枝桿菌具有截短的非功能性的erm(41)基因[4]，即使延長(zhǎng)耐藥檢測(cè)孵育時(shí)間也無(wú)法誘導(dǎo)克拉霉素耐藥，而本研究中有2株馬賽分枝桿菌對(duì)克拉霉素表現(xiàn)為誘導(dǎo)性耐藥，其發(fā)生機(jī)制目前還不清楚，有待進(jìn)一步研究。Bastian等[10]研究表明，rrl基因突變發(fā)生在erm(41)T28基因型菌株中，而本研究中erm(41)T28和erm(41)C28基因型膿腫分枝桿菌中均發(fā)生了rrl基因突變，表明rrl基因的選擇突變?cè)趀rm(41)T28和erm(41)C28基因型菌株中相似，推測(cè)這可能與患者治療史有關(guān)。而7株對(duì)克拉霉素耐藥的馬賽分枝桿菌在rrl基因的2058/2059位點(diǎn)無(wú)突變，其耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，erm(41)T28基因型膿腫分枝桿菌更易誘導(dǎo)克拉霉素耐藥。膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌最常見(jiàn)的獲得性耐藥突變位點(diǎn)分別是A2058C和A2058G。