含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 對副溶血弧菌毒力的影響

朱馨媛, 劉敏, 黃穎, 趙哲

河海大學(xué)海洋學(xué)院海洋生物系, 江蘇 南京 210098

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌, 廣泛分布于海洋環(huán)境中, 能夠引發(fā)多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的疾病(Soto-Rodriguez et al,2015)。副溶血弧菌同樣能引發(fā)人類感染, 食用受副溶血弧菌污染且烹調(diào)不當(dāng)?shù)乃a(chǎn)品會引發(fā)急性腸胃炎, 傷口暴露于存在副溶血弧菌的環(huán)境中會引起傷口感染, 嚴(yán)重時(shí)會引發(fā)敗血癥, 導(dǎo)致死亡(Li et al,2019)。在正常水生環(huán)境中, 副溶血弧菌的多數(shù)毒力因子不表達(dá), 當(dāng)病菌進(jìn)入宿主或受到其他外源刺激時(shí), 才會激活相應(yīng)調(diào)控通路, 從而激活毒力因子表達(dá)(Ceccarelli et al, 2013)。

鐵是氧的載體和電子傳遞的催化劑, 是微生物生長所必需的微量元素。鐵不足會抑制微生物生長、定殖等重要的生理活動(León-Sicairos et al, 2015;Payne et al, 2016)。由于宿主體內(nèi)可利用的游離鐵稀少, 微生物進(jìn)化出從宿主體內(nèi)獲取鐵的生理機(jī)制,這一過程往往伴隨著細(xì)菌對宿主的毒力作用(Payne,1993; Abu Kwaik et al, 2013; Brophy et al, 2015; Leó n-Sicairos et al, 2015)。鐵離子濃度作為一種信號,控制著微生物的基因表達(dá)和調(diào)控, 其中包括多種鐵代謝通路蛋白、毒力因子, 以及毒力調(diào)控蛋白(Davies et al, 2011; Mey et al, 2005b; Payne et al,2016)。針對環(huán)境中難溶的鐵化合物, 細(xì)菌還能通過自身分泌或利用其他菌分泌的載體蛋白, 獲得鐵元素(Raymond et al, 2003; Miethke et al, 2007)。相關(guān)研究表明, 外源鐵能夠增強(qiáng)副溶血弧菌對宿主的致病力, 其主要原因是補(bǔ)充鐵元素能夠促進(jìn)病菌的增殖(León-Sicairos et al, 2015)。

細(xì)菌的運(yùn)動能力與致病能力緊密相關(guān), 能夠影響其在不同環(huán)境中的定殖、表面接觸和生物膜的形成(Belas, 2014; Van Laar et al, 2018)。副溶血弧菌擁有雙鞭毛系統(tǒng), 其中周生鞭毛使弧菌能夠進(jìn)行群集運(yùn)動(McCarter et al, 1990), 從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用, 影響其遷移、黏附和在感染部位的分布(Kearns, 2010)。生物膜是微生物及其胞外產(chǎn)物在生物或非生物表面形成的混合物。包裹在生物膜中的細(xì)菌受到環(huán)境的影響變小, 其耐藥性、抗逆性增強(qiáng), 生物生產(chǎn)力和相互作用提高(Muhammad et al,2020)。副溶血弧菌的運(yùn)動能力和生物膜形成均受到環(huán)境中鐵離子濃度的影響。研究發(fā)現(xiàn), 低鐵條件能夠促進(jìn)副溶血弧菌群集運(yùn)動的活性和周生鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)(McCarter et al, 1989; Gode-Potratz et al,2010; Morabe et al, 2020), 抑制生物膜的形成(Payne et al, 2016)。當(dāng)存在外界鐵載體蛋白時(shí), 副溶血弧菌的生長和生物膜形成均受到抑制(Zhang et al, 2016),這暗示外源鐵載體蛋白可能對菌株毒力產(chǎn)生影響。因此, 與鐵代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可能調(diào)控群集運(yùn)動活性和生物膜的形成。目前, 外界鐵離子濃度對群集運(yùn)動和生物膜形成的調(diào)控機(jī)制仍不清楚, 需要進(jìn)一步研究。

副溶血弧菌除了能表達(dá)弧菌素, 還能利用外源產(chǎn)氣菌素(Funahashi et al, 2003)、 高鐵色素(Funahashi et al, 2009)、腸桿菌素(Tanabe et al, 2012)等鐵載體中的鐵元素, 以滿足自身生長需求。Tanabe等(2014) 發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌VPA0150編碼了含鐵腸桿菌素受體 PeuA, 其上游存在雙組分系統(tǒng)VPA0148-VPA0149 使VPA0150在特定位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)錄, 從而表達(dá)出具有活性的受體蛋白。VPA0148 是含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白, 該蛋白的基因VPA0148與下游組氨酸激酶基因VPA0149形成一個(gè)操縱子, 在堿性且低鐵條件下發(fā)生共轉(zhuǎn)錄(Tanabe et al, 2014)。同時(shí),VPA0148-VPA0149可能受Fur(Ferric uptake regulation)系統(tǒng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(Tanabe et al, 2014),推測VPA0148 可能參與了副溶血弧菌的毒力調(diào)控。本研究中, 通過敲除副溶血弧菌RIMD2210633 的VPA0148, 并檢測缺失株生長、生物膜形成、群集運(yùn)動以及斑馬魚致死率等表型的變化, 發(fā)現(xiàn)了含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 具有負(fù)調(diào)控副溶血弧菌毒力的作用, 結(jié)果進(jìn)一步支撐了鐵調(diào)節(jié)副溶血弧菌毒力的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

本研究所采用菌株和質(zhì)粒已列于表1。液體培養(yǎng)基使用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基和心浸液培養(yǎng)基(Bacto? Heart Infusion Broth), 瓊脂培養(yǎng)基中額外添加15g·L-1瓊脂粉(上海生工)。本研究中普通培養(yǎng)基為未添加螯合劑的培養(yǎng)基, 低鐵培養(yǎng)基為添加了100μmol·L-12,2′-聯(lián)吡啶(2,2′-dipyridy, 上海生工)的普通培養(yǎng)基?？股氐氖褂脻舛葹榭敲顾?0μg·mL-1, 氯霉素(大腸桿菌)25μg·mL-1, 氯霉素(副溶血弧菌)5μg·mL-1。

表1 本研究中使用的菌株和質(zhì)粒Tab. 1 Strains and plasmids

1.2 基因缺失和回補(bǔ)株構(gòu)建

VPA0148基因敲除采用同源重組的方式進(jìn)行,引物詳見表2。用引物d0148-1F/1R 和d0148-2F/2R通過PCR 分別擴(kuò)增出VPA0148上下游DNA 片段,并通過二次擴(kuò)增, 利用引物d0148-1R、d0148-2F 中的同源臂序列, 將上下游片段相連、得到VPA0148缺失后的DNA 片段。該片段及載體質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶XhoI、SacI(Takara)酶切后, 用T4 連接酶(Thermo Fisher)連接, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coliS17-1λpir菌株中?；匮a(bǔ)質(zhì)粒中的目的片段使用引物p0148-F/R 擴(kuò)增, 使用One Step Cloning Kit(南京諾維贊)將該片段通過同源臂重組到自殺質(zhì)粒pDM4 上, 并將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coliS17-1λpir菌株中。通過S17-1λpir的接合作用, 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到目標(biāo)弧菌內(nèi), 在含有5μg·mL-1氯霉素的平板上篩選出攜帶質(zhì)粒的弧菌菌株, 并利用載體引物通過PCR 驗(yàn)證質(zhì)粒存在?；蚯贸枰M(jìn)一步在含有蔗糖的培養(yǎng)基中篩選成功缺失基因VPA0148的菌株, 用引物RT0148-F/R 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證; 并在含氯霉素的平板上驗(yàn)證基因缺失的菌株不含自殺質(zhì)粒。

表2 本研究中所使用的引物Tab. 2 Primers in this research

1.3 生長曲線測定

本實(shí)驗(yàn)在含有1% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中進(jìn)行。副溶血弧菌經(jīng)過夜活化后, 在高鐵或低鐵的心浸液培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2h。調(diào)菌液濃度相等后, 1%接種到高鐵或低鐵的心浸液培養(yǎng)基中并分裝到培養(yǎng)板, 每孔400μL 菌液, 用Bioscreen 全自動生長曲線測定儀測定24h 生長曲線, 37℃振蕩培養(yǎng), 每小時(shí)檢測一次。

1.4 斑馬魚死亡率檢測

實(shí)驗(yàn)步驟參考之前的研究(Kinkel et al, 2010)。選用 AB 系野生型 6～9 月齡斑馬魚, 養(yǎng)殖于含0.06g·L-1NaCl 的去離子水中, 實(shí)驗(yàn)前禁食24h。過夜培養(yǎng)的菌株 1%接種活化并將培養(yǎng)基更換為0.75%生理鹽水, 調(diào)濃度為5×107cfu·mL-1。斑馬魚腹腔注射使用微量注射器進(jìn)行, 每尾注射10μL, 每10尾魚一組, 注射后每4h 或8h 觀察一次, 持續(xù)觀察48h。對照組每尾魚注射10μL 0.75%生理鹽水。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 生物膜生成量檢測

實(shí)驗(yàn)步驟參考之前的研究(O'Toole et al, 1998)。將過夜活化的菌株1%接種于含1% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中, 分裝于96 孔板中, 37℃, 100r·min-1培養(yǎng)24h。棄液相, 用1×Phosphate-buffered saline(PBS,0.01mol·L-1, pH 7.2～7.4, Bio-Channel)輕柔洗去各孔中菌液后, 吸凈液體, 用0.1% (wt/vol)結(jié)晶紫在室溫下染色30min。染色完成后棄染液, 用1×PBS 洗凈殘余染料, 再加入 200μL 乙醇, 室溫下反應(yīng)30min。檢測各孔在595nm 下的吸光值。

1.6 群集運(yùn)動能力檢測

群集運(yùn)動檢測方法參考之前的研究(Gode-Potratz et al, 2010)。將2μL 普通心浸液培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的飽和菌液, 滴在含有100μmol·L-12,2’-聯(lián)吡啶的心浸液-瓊脂平板上, 置于30℃培養(yǎng)12h, 測量其擴(kuò)散范圍的大小。每個(gè)樣重復(fù)3 次, 每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.7 熒光定量PCR 分析VPA0148 的轉(zhuǎn)錄水平

在含3% NaCl 的LB 培養(yǎng)基、含1%和3% NaCl的心浸液培養(yǎng)基中, 1%接種過夜活化的野生型菌株,37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。通過向上述培養(yǎng)基中加入鐵離子特異性螯合劑2,2′-聯(lián)吡啶(2,2′-dipyridyl)創(chuàng)造低鐵環(huán)境。將對數(shù)生長期的菌液離心, 用相應(yīng)的低鐵培養(yǎng)基重懸菌體, 繼續(xù)在37℃培養(yǎng)40min。

取培養(yǎng)完成的菌液離心后棄培養(yǎng)基, 用 1mL TRIzol?溶液(Thermo Fisher)溶解并加入200μL 氯仿,振蕩混勻并于冰上放置10min 后, 12000×g、4℃離心15min。取500μL 清與等體積異丙醇混合, 冰上放置5min 后12000×g、4℃離心10min, 棄液相。用1mL 70%乙醇洗沉淀一次, 得到RNA 粗提物并溶解。去除RNA 粗體物中的DNA, 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反應(yīng)得到cDNA。

熒光定量PCR 使用rpoA為內(nèi)參, 以cDNA 為模板, 采用 10μL 反應(yīng)體系(5μL AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix; 4μL ddH2O; 正反引物各0.25μL, 終濃度為2.5μmol·L-1; 0.5μL cDNA)在羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行。數(shù)據(jù)以2-Δ(ΔCT)法進(jìn)行相對定量分析, 采用SPSS22 軟件、雙邊T 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)是否具有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 VPA0148 對副溶血弧菌毒力的影響

通過斑馬魚腹腔注射實(shí)驗(yàn), 探究VPA0148 對副溶血弧菌斑馬魚致死能力的影響。結(jié)果顯示:VPA0148缺失株(ΔVPA0148)表現(xiàn)出比野生型菌株(WT)更高的生物致死率和致死速度(圖1)。

圖1 VPA0148 對副溶血弧菌致斑馬魚死亡能力的影響使用不同菌株對斑馬魚進(jìn)行腹腔注射后, 每4h 或8h 觀察死亡情況。WT: 副溶血弧菌RIMD 2210633 野生型菌株; ΔVPA0148: VPA0148缺失株; ΔVPA0148::pVPA0148: VPA0148 缺失株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒; 對照組: 注射0.75%生理鹽水的處理組Fig. 1 VPA0148 inhibiting the lethality of V. parahaemolyticus to zebrafish

在注射感染4h 后, ΔVPA0148與WT 感染的斑馬魚開始出現(xiàn)死亡。感染4～12h 期間, 不同實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)大量死亡, 而ΔVPA0148感染的斑馬魚死亡數(shù)量更多。感染20h 之后, 各實(shí)驗(yàn)組中存活的斑馬魚數(shù)量趨于穩(wěn)定。向ΔVPA0148中回補(bǔ)VPA0148基因顯著降低了菌株對斑馬魚的致死速度和致死率。同時(shí), ΔVPA0148:: pVPA0148感染的斑馬魚的死亡速度和死亡數(shù)量又略低于 WT 感染組, 說明回補(bǔ)VPA0148后, 菌株對斑馬魚的致死能力下降; 而ΔVPA0148::pVPA0148致死能力低于WT, 可能的原因是作為VPA0148基因載體的高拷貝質(zhì)粒pBBR1-MCS-1 提高了VPA0148的表達(dá)量(與WT 相比)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了VPA0148 對菌株的毒力有抑制作用。

2.2 VPA0148 的表達(dá)量受環(huán)境中鐵離子濃度和NaCl 濃度的影響

通過熒光定量 PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)確定VPA0148在不同條件下的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在含有1% NaCl的心浸液培養(yǎng)基中加入螯合劑后(低鐵條件),VPA0148的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最高, 因此隨后對菌株毒力表型的檢測實(shí)驗(yàn)在此培養(yǎng)條件下進(jìn)行。對比兩種不同NaCl 濃度的心浸液培養(yǎng)基中VPA0148的表達(dá)倍數(shù)差異, 可以發(fā)現(xiàn)NaCl 可能在一定程度上抑制了液體培養(yǎng)條件下菌株中VPA0148的表達(dá); 對比3% NaCl 濃度的LB 和心浸液培養(yǎng)基中VPA0148表達(dá)量的倍數(shù)差異, 可以發(fā)現(xiàn)LB 中VPA0148在低鐵條件下的表達(dá)量更高(圖2)。以上結(jié)果說明VPA0148的表達(dá)受環(huán)境中鐵離子和NaCl 濃度的影響, 在1%NaCl 心浸液培養(yǎng)基中, 鐵離子的降低能更顯著地誘導(dǎo)VPA0148的表達(dá)。

圖2 相同NaCl 濃度和限鐵條件下VPA0148 的轉(zhuǎn)錄分析3LB_LB: 含3% NaCl 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含3%NaCl 的LB 培養(yǎng)基中; 3LB_DP: 含3% NaCl 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含3% NaCl 的添加了螯合劑的LB 培養(yǎng)基中;3LB_DMEM: 含3% NaCl 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到DMEM 培養(yǎng)基中; 3HI_HI: 含3% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含3% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中; 3HI_DP: 含3%NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含3% NaCl 的添加了螯合劑的心浸液培養(yǎng)基中; 3HI_DMEM: 含3% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到 DMEM 培養(yǎng)基中; 1HI_HI: 含 1%NaCl 的普通心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含1% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中; 1HI_DP: 含1% NaCl 的普通心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到含1% NaCl 的添加了螯合劑的心浸液培養(yǎng)基;1HI_DMEM: 含1% NaCl 的普通心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到DMEM 培養(yǎng)基中。qPCR 檢測VPA0148 的轉(zhuǎn)錄水平。顯著性: *P＜0.05, **P＜0.01, ****P＜0.0001Fig. 2 Relative VPA0148 mRNA transcriptional levels under different concentrations of NaCl and iron-limiting condition

DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)是培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的常用培養(yǎng)基,其中含有20mmol·L-1FeCl3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在1%NaCl 心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株, 經(jīng)DMEM 培養(yǎng)基處理后,VPA0148表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高(圖2)。但各處理組中, DMEM 處理后VPA0148的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)都遠(yuǎn)低于在培養(yǎng)基中直接加入鐵離子螯合劑的處理組。以上結(jié)果說明DMEM 能夠誘導(dǎo)VPA0148表達(dá)上調(diào)。

2.3 VPA0148 對副溶血弧菌在低鐵條件下生長的影響

通過檢測生長曲線, 探究VPA0148 在低鐵條件下對菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在普通心浸液培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到添加了鐵離子螯合劑的低鐵培養(yǎng)基中后,VPA0148缺失株ΔVPA0148的生長速度高于 WT; 回補(bǔ)VPA0148后, 菌株ΔVPA0148::pVPA0148的生長速度在轉(zhuǎn)接后10h 內(nèi)與WT 相近, 而在野生型菌株中額外表達(dá)VPA0148 后,WT::pVPA0148在低鐵環(huán)境中的生長速度低于WT(圖3b)。比較在普通心浸液培養(yǎng)基以及在添加了鐵螯合劑的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)的菌株可以發(fā)現(xiàn), 缺失株的生長速率最高, 野生型菌株中過量表達(dá)VPA0148 使菌株生長速率降低(圖3a、c)。

圖3 VPA0148 對副溶血弧菌在低鐵條件下生長的影響本實(shí)驗(yàn)使用的心浸液培養(yǎng)基中含1% NaCl。將過夜培養(yǎng)的菌株分別轉(zhuǎn)接到心浸液培養(yǎng)基(a)或含螯合劑的心浸液培養(yǎng)基(b)中; 將在含螯合劑的心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株, 轉(zhuǎn)接到含螯合劑的心浸液培養(yǎng)基(c)中, 測定生長曲線。WT: 野生型菌株; ΔVPA0148: VPA0148缺失株; ΔVPA0148::pVPA0148: VPA0148 缺失株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒; WT::pVPA0148: 野生型菌株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒Fig. 3 VPA0148 inhibiting the growth of V. parahaemolyticus under low-iron condition

2.4 VPA0148 對副溶血弧菌群集運(yùn)動能力的影響

本實(shí)驗(yàn)首先比較了在不同NaCl 濃度的心浸液固體培養(yǎng)基上野生菌株群集運(yùn)動能力的差別, 發(fā)現(xiàn)在含3% NaCl、1.5%瓊脂的心浸液固體培養(yǎng)基上,菌株的群集運(yùn)動更為顯著(圖 4a), 這可能是由于NaCl 濃度影響了平板的表面張力(Yang et al, 2017)。在含有3% NaCl 的上述平板上檢測VPA0148 對菌株群集運(yùn)動能力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 缺失株ΔVPA0148的群集運(yùn)動能力顯著高于野生株(P＜0.05), 而回補(bǔ)了該基因后, 菌株的群集運(yùn)動能力恢復(fù)至與野生型相近的水平, 過量表達(dá)VPA0148的WT::pVPA0148菌株表現(xiàn)出更低的群集運(yùn)動能力(圖4)。以上結(jié)果說明了VPA0148 能夠抑制副溶血弧菌的群集運(yùn)動能力。

圖4 VPA0148 對副溶血弧菌群集運(yùn)動活性的影響a. 不同NaCl 濃度心浸液-瓊脂平板上菌株的運(yùn)動范圍; b. 3% NaCl 濃度心浸液-瓊脂平板上不同菌株的運(yùn)動范圍。WT: 野生型菌株;ΔVPA0148: VPA0148 缺失株; ΔVPA0148::pVPA0148: VPA0148 缺失株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒; WT::pVPA0148:野生型菌株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒。顯著性: *P＜0.05 Fig. 4 VPA0148 inhibiting the swarming activity of V. parahaemolyticus

2.5 VPA0148 對副溶血弧菌的生物膜形成的影響

通過結(jié)晶紫染色法, 在含有1% NaCl 的心浸液培養(yǎng)基中檢測VPA0148對菌株生物膜形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 24h 時(shí)ΔVPA0148生物膜的形成量顯著高于WT, ΔVPA0148::pVPA0148的生物膜形成量與WT 相當(dāng), 而過量表達(dá)VPA0148 會降低菌株的生物膜形成量(圖5)。以上結(jié)果說明VPA0148 對副溶血弧菌生物膜的形成有抑制作用。

圖5 VPA0148 對副溶血弧菌生物膜形成的影響WT: 野 生 型 菌 株 ; ΔVPA0148: VPA0148 缺 失 株 ;ΔVPA0148::pVPA0148: VPA0148 缺失株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒; WT::pVPA0148: 野生型菌株中回補(bǔ)帶有VPA0148 基因的 pBBR1-MCS-1 質(zhì)粒。顯著性: *P＜0.05,****P＜0.0001Fig. 5 VPA0148 inhibiting the biofilm formation of V.parahaemolyticus

3 討論

低鐵濃度是宿主體內(nèi)刺激病原菌攝鐵系統(tǒng)和毒力相關(guān)基因表達(dá)的一種信號。副溶血弧菌的攝鐵系統(tǒng)包括鐵螯合物和膜上鐵受體。除了通過分泌弧菌鐵蛋白獲取胞外鐵離子, 副溶血弧菌還能利用其他細(xì)菌分泌的鐵載體, 如產(chǎn)氣菌素、高鐵色素和腸桿菌素。在副溶血弧菌中, 已知的腸桿菌素受體有IrgA、VctA和 PeuA, 分別由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 IrgB、VctR 和VPA0148 調(diào)控表達(dá)(Tanabe et al, 2012,2014)。本研究發(fā)現(xiàn), 在副溶血弧菌RIMD 2210633 中, 含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 對菌株毒力存在負(fù)調(diào)節(jié)作用。在低鐵條件下,VPA0148的缺失能夠提高菌株的生長速率和群集運(yùn)動的能力。VPA0148的缺失同時(shí)還增加了生物膜的形成量, 以及菌株對生物的致死能力。接下來, 我們將研究VPA0148 調(diào)控群集運(yùn)動和生物膜形成的分子機(jī)制, 同時(shí)還需要探究VPA0148-VPA0149 的相互作用及在相關(guān)調(diào)控中的作用。

當(dāng)環(huán)境中可利用的鐵濃度不足時(shí), 細(xì)菌的生物膜形成受到抑制, 這可能是由于胞外多糖對鐵具有螯合作用, 形成生物膜后細(xì)菌更難獲取鐵(Payne et al, 2016)。在霍亂弧菌中, 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)受到影響時(shí), 菌株的運(yùn)動性和生物膜形成能力均受到抑制(Davis et al, 2005; Mey et al, 2005a)。因此轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 可能同時(shí)參與了副溶血弧菌外源鐵的攝取和細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié), 從而抑制生物膜的形成和群集運(yùn)動的能力。同時(shí), 霍亂弧菌(Vibrio cholera)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)等其他致病弧菌的毒力均受到細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的調(diào)節(jié)(León-Sicairos et al, 2015)。TonB 是鐵代謝通路中的能量傳輸系統(tǒng), 研究證明在創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)中, TonB 的缺失減弱了菌株對宿主的致死能力(Seliger et al, 2001; Stork et al, 2004; Wang et al, 2008; Alice et al, 2008), 說明當(dāng)弧菌存在鐵攝取缺陷時(shí), 其毒力受到較大影響。在鰻弧菌中, 鐵載體蛋白的缺失使菌株喪失了對動物的致死能力(Payne, 1993)。我們的研究證明了含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 的缺失使菌株的斑馬魚致死能力增加, 這種調(diào)控可能與VPA0148 調(diào)控含鐵腸桿菌素受體合成有關(guān)。

本研究進(jìn)一步說明外界鐵濃度對菌株代謝和毒力的調(diào)節(jié)是一個(gè)精密復(fù)雜的過程。研究已知, 細(xì)菌中存在Fur(ferric uptake regulation)系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境中的鐵離子濃度, 調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。當(dāng)外界鐵離子濃度偏高時(shí), Fur 蛋白結(jié)合Fe2+, 其活性受到激活并結(jié)合在目標(biāo)基因啟動子處阻止基因轉(zhuǎn)錄; 當(dāng)鐵離子濃度降低后, Fur-Fe 中的鐵離子被釋放, 失活的Fur從結(jié)合位點(diǎn)脫離, 從而恢復(fù)了目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄(Morabe et al, 2020)。之前的研究發(fā)現(xiàn)Fur 能夠結(jié)合VPA0148的啟動子(Tanabe et al, 2014), 這可能是鐵調(diào)控VPA0148表達(dá)的一個(gè)原因。在霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等多種弧菌中, Fur 被證明通過多種途徑調(diào)控了菌株毒力(León-Sicairos et al, 2015)。由此推測, 當(dāng)環(huán)境中缺乏鐵元素時(shí), 含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 表達(dá)量升高, 抑制菌株生長以應(yīng)對不良的營養(yǎng)條件; 這可能是缺乏該蛋白基因時(shí), 病菌致死能力下降的重要原因。

當(dāng)環(huán)境中鐵濃度過低時(shí), 細(xì)胞會大量合成定位在細(xì)胞膜上的通道蛋白和受體蛋白, 以向胞外運(yùn)輸鐵載體以及捕獲和向胞內(nèi)運(yùn)送外源含鐵蛋白, 這個(gè)過程會增加細(xì)胞膜壓力(Acosta et al, 2015) 。 由于VPA0148-VPA0149 是胞膜壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)CpxRS 的同源蛋白, 其可能響應(yīng)了攝鐵系統(tǒng)表達(dá)所造成的細(xì)胞膜壓力的變化(Acosta et al, 2015)。在霍亂弧菌中, Cpx 系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)能夠受低鐵條件的誘導(dǎo)表達(dá), 并能夠調(diào)節(jié)眾多參與鐵代謝和獲取的基因表達(dá), 同時(shí)調(diào)節(jié)關(guān)鍵毒力調(diào)節(jié)因子ToxRS的表達(dá)(Acosta et al, 2015)。因此,VPA0148-VPA0149 抑制了其他可能增加細(xì)胞膜壓力的生理活動, 如群集運(yùn)動和生物膜形成。

副溶血弧菌的毒力因子主要包括黏附因子、脂多糖、溶血素(耐熱直接溶血素TDH 和TDH 相關(guān)溶血素TRH)、兩種Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system, T3SS1 and T3SS2)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵsecretion system, T6SS)、鐵代謝系統(tǒng)等(Li et al,2019)。其中, 溶血素主要與細(xì)胞毒性、腸毒性有關(guān),TDH 直接作用于紅細(xì)胞, 具有溶血活性、腸毒性、心臟毒性和細(xì)胞毒性。T3SS1 主要與菌株運(yùn)動能力、細(xì)胞毒性、生物膜形成能力有關(guān), 對菌株的腸定植能力具有負(fù)調(diào)控作用(Hiyoshi et al, 2010; Hubbard et al, 2016); T3SS2 被證明與腸毒性有關(guān), 能夠破壞細(xì)胞骨架和操縱信號傳導(dǎo), 并調(diào)控炎癥因子釋放, 有助于在宿主體內(nèi)的免疫逃避, 被認(rèn)為是副溶血弧菌最主要的致病因子(Hiyoshi et al, 2010; Calder et al,2014); T6SS 介導(dǎo)了病菌的細(xì)胞黏附和侵襲, 能夠引起細(xì)胞自噬(Yu et al, 2015)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 鐵對副溶血弧菌的毒力有諸多影響。VPA0148 是否對其他毒力因子的表達(dá)存在調(diào)控仍有待探究。接下來我們會探究T3SS 系統(tǒng)的基因表達(dá)及其他毒力是否受到VPA0148 調(diào)控。之前的研究發(fā)現(xiàn), 鐵及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白可以調(diào)控細(xì)菌的黏附能力(Hackney et al, 1980;Zhang et al, 2020), 未來我們將進(jìn)一步探究VPA0148 對副溶血弧菌中多種黏附蛋白基因表達(dá)及其細(xì)胞黏附能力的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)含鐵腸桿菌素受體調(diào)節(jié)蛋白VPA0148 能夠調(diào)節(jié)副溶血弧菌生長、運(yùn)動、生物膜形成和生物致死能力, 初步揭示了腸桿菌素受體調(diào)控與副溶血弧菌毒力的關(guān)系, 增進(jìn)了對鐵調(diào)節(jié)副溶血弧菌毒力的機(jī)制的了解。本研究結(jié)果為后續(xù)探究VPA0148 調(diào)控副溶血弧菌毒力的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持, 也為解析副溶血弧菌雙組分系統(tǒng)調(diào)控毒力的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。