外泌體在非小細(xì)胞肺癌診斷及治療中的作用

朱 鵬 張志明 雍文興 王功臣 呼永華 宋忠陽(yáng) 吳亞娜 蘇 歡 杜婷婷

肺癌是全球發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lunch cancer,NSCLC)發(fā)生率占據(jù)了肺癌的絕大多數(shù)[1]。Ⅰ期NSCLC患者術(shù)后5年生存率可達(dá)80%以上，但由于早期特異性診斷標(biāo)志物缺乏等原因，NSCLC患者確診之時(shí)往往已處于晚期，故NSCLC患者的5年生存率僅為5%左右[2]。因而迫切需要發(fā)現(xiàn)敏感度、準(zhǔn)確率更高的早期診斷方法及治療方法以提高NSCLC患者的生存率。近年來(lái)，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)迅猛發(fā)展，人們對(duì)外泌體有了更深入的研究，外泌體攜帶的多種生物分子活性成分參與細(xì)胞的遷移、通信與生長(zhǎng)、血管的新生等生理和病理學(xué)過(guò)程[3]。因此，外泌體為NSCLC提供了新的研究途徑，能夠成為早期診斷和治療的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[4]。

一、外泌體概述

1.外泌體的起源、結(jié)構(gòu)、組成及分布：外泌體(exosomes)是由多種活性細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡，最早可追溯到1983年，是Johnstone等在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)并命名的[5]。質(zhì)膜循環(huán)途徑中的膜腔或早期胞內(nèi)體是其產(chǎn)生的起源，而后向內(nèi)凹陷形成管腔內(nèi)膜泡并發(fā)展成多泡小體，在細(xì)胞內(nèi)分子馬達(dá)的牽引下，多泡小體與細(xì)胞表面融合，最終被分泌出去，此被稱(chēng)之為“內(nèi)吞-融合-外排”調(diào)控過(guò)程[6]。外泌體形態(tài)規(guī)則，呈杯狀或雙凹蝶形，大小均勻，直徑為30～100nm。外泌體其內(nèi)含大量的生物活性物質(zhì)如：①蛋白質(zhì)：由在外泌體中普遍存在的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白(Alix、Rab蛋白、TSG101、G蛋白等)、細(xì)胞骨架成分蛋白、整合素和四跨膜蛋白(CD81、CD63、CD9等)等固有蛋白及與細(xì)胞來(lái)源和組織類(lèi)型相關(guān)的特異性蛋白兩大類(lèi)組成[7]；②核酸：包括長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)、各種RNA亞型、雙鏈DNA、微小RNA(microRNA或miRNA)等[8]；③脂質(zhì)：包括磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)節(jié)苷脂、膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂等[9]。無(wú)論在生理或病理?xiàng)l件下，一些細(xì)胞均可以胞吐的方式將外泌體釋放入各種體液之中，包括尿液、血液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、母乳、精液、羊水、腦脊液、腹腔積液、膽汁等，通常采用差速離心法可得到外泌體[10]。

2.外泌體的生物學(xué)特性：經(jīng)研究證明，外泌體在各種細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中起著重要的作用，作為細(xì)胞外微環(huán)境的重要成分之一，歸結(jié)起來(lái)，外泌體的生物學(xué)功能如下[11]：(1)細(xì)胞通訊與物質(zhì)傳遞。首先，外泌體可參與細(xì)胞間信息傳遞及物質(zhì)運(yùn)輸：外泌體不僅能夠作為信號(hào)復(fù)合物通過(guò)受體介導(dǎo)直接刺激靶細(xì)胞，還可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、膜受體等生物活性成分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，從而影響靶細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯并調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，最終改變靶細(xì)胞的表型及功能狀態(tài)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它在改變相鄰細(xì)胞的生物學(xué)功能的同時(shí)還可對(duì)相距遙遠(yuǎn)細(xì)胞的功能產(chǎn)生重要影響。(2)促進(jìn)血管與神經(jīng)新生。外泌體可促進(jìn)血管的生成進(jìn)而促使傷口愈合，又可促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)。(3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。(4)參與免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)。(5)介導(dǎo)抗原遞呈等。

二、外泌體在NSCLC早期診斷中的作用

外泌體與其他生物學(xué)標(biāo)志物比較有著明顯的優(yōu)勢(shì)，其生物活性物質(zhì)miRNA和蛋白質(zhì)因受雙層脂質(zhì)保護(hù)可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于血清、血漿或其他體液之中而免受蛋白酶或RNA酶的降解。同時(shí)，在癌癥患者體液中外泌體更容易被分離和分析，因此外泌體可能替代NSCLC傳統(tǒng)的診斷方法應(yīng)用于臨床，成為在臨床診斷中較理想的生物學(xué)標(biāo)志物。

1.外泌體相關(guān)miRNA與NSCLC的診斷：miRNAs是一類(lèi)含有20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，可通過(guò)結(jié)合其靶mRNAs的3′ UTR來(lái)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)的改變。通過(guò)對(duì)正常肺組織和NSCLC肺組織對(duì)比發(fā)現(xiàn)，NSCLC肺組織中miRNAs的表達(dá)量明顯較高，目前miRNAs多被發(fā)現(xiàn)存在于NSCLC患者的外泌體中，參與NSCLC的形成及演化過(guò)程。因此，外泌體的miRNA具有成為NSCLC診斷標(biāo)志物的潛質(zhì)。Poroyko等[12]在NSCLC患者血清中發(fā)現(xiàn)7個(gè)外泌體miRNA (hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-16-2-3p及hsa-miR-15b-5p) 的敏感度均≥83.33%，特異性均≥87.50%，AUC均≥0.88，且與健康志愿者的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明血清外泌體miRNAs有成為早期診斷NSCLC的潛力。但化療后NSCLC患者血清中無(wú)可用于鑒別與健康志愿者的特異性外泌體miRNAs。

余昌敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中3個(gè)miRNA(hsa-miR-451a、hsa-miR-331-5p及hsa-miR-363-3p)可依靠100%的特異性和敏感度來(lái)鑒別出治療前的NSCLC和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)患者。說(shuō)明這些血清外泌體中對(duì)于NSCLC診斷具有高敏感度的miRNAs同時(shí)還具有鑒別SCLC和NSCLC的能力，有望在不久的將來(lái)成為NSCLC早期篩查診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Jin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血漿外泌體中的miR-24-3p、let-7b-5p及miR-486-5p含量明顯高于健康對(duì)照者但let-7e-5p水平較其降低。為進(jìn)一步研究及證明外泌體miRNAs對(duì)NSCLC早期的診斷價(jià)值，Jin等聯(lián)合其他團(tuán)隊(duì)對(duì)60例尚未確診的NSCLC患者血漿中l(wèi)et-7e-5p、let-7b-5p、miR-486-5p4及miR-23a-3p等外泌體的差異性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，最終鑒別出43例NSCLC患者，因此，外泌體相關(guān)miRNA這種無(wú)創(chuàng)且高敏感度的診斷方法可提高NSCLC的早期診斷率。此外，Su等[15]查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，利用qPCR技術(shù)和miRNA測(cè)序檢測(cè)42例健康志愿者及41例Ⅰ期NSCLC患者血漿外泌體中的Ct值及其miRNA，以篩選診斷NSCLC的特異性miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-361b-5p、miR-181b-5p、miR-320b及miR-10b-5p這4種miRNA具有鑒別NSCLC、肺鱗癌及肺腺癌患者的能力，說(shuō)明外泌體中的miRNA在肺癌的診斷及鑒別診斷中發(fā)揮著重大作用，并為尋找診斷早期NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物提供理論依據(jù)，進(jìn)而可能會(huì)代替組織活檢成為診斷NSCLC的非侵入性分子標(biāo)志物。

美國(guó)Exosome Diagnostics公司于2016年初研發(fā)的基于血漿外泌體的間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)試劑盒已被相關(guān)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床，這是世界上第1個(gè)以血漿為樣本分析外泌體RNA的臨床檢測(cè)[16]。它可以實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)NSCLC患者EML4-ALK融合基因突變的情況，該項(xiàng)檢測(cè)也被證明具有高達(dá)100%的診斷特異性和88%的診斷敏感度。

2.外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)與NSCLC的診斷：據(jù)研究報(bào)道，外泌體中除miRNA外的特異性蛋白質(zhì)也可以作為診斷篩查NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物并可促進(jìn)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，是早期診斷NSCLC的有效途徑。有研究者對(duì)NSCLC患者和健康志愿者血清ELISA檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ECM1及AH-SG外泌體蛋白在NSCLC患者與健康志愿者間的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特異性為56.6%，敏感度為75.0%，AUC為0.656 (95% CI:0.528～0.785)[17]。他們還將ECM1和AH-SG聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NSCLC及早期NSCLC患者，特異性為54.3%，敏感度為87.5%，AUC為0.739 (95% CI: 0.621～0.858)，這顯著提高了NSCLC患者診斷的敏感度。另有報(bào)道稱(chēng)，NSCLC患者血漿外泌體中高表達(dá)的EGFR、CD91及CD317等蛋白均可作為NSCLC早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物且多個(gè)外泌體蛋白標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC診斷更具優(yōu)勢(shì)[18]。

近年來(lái)，基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究使得對(duì)NSCLC外泌體蛋白質(zhì)的篩選方法提升到了新的高度，這為我們提供了更多具有生物學(xué)標(biāo)志物價(jià)值的分子。Clark等[19]運(yùn)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸的方法檢測(cè)并分析了NSCLC患者和健康對(duì)照者支氣管上皮細(xì)胞外泌體之間的721種生物蛋白的差異性表達(dá)，篩選出了溶質(zhì)載體家族3成員2、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子、溶酶體膜糖蛋白2及癌胚抗原相關(guān)黏附分子6等多種對(duì)NSCLC診斷篩查具有高特異性和敏感度的蛋白標(biāo)志物，若將其開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于NSCLC患者液體活檢的外泌體蛋白診斷芯片，較單一的生物學(xué)標(biāo)志物將具有更高的開(kāi)發(fā)和診斷價(jià)值。Sandfeld-Paulsen等[20]研究了127例健康對(duì)照者和336例肺癌患者血漿外泌體中49種蛋白表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，CD151、CD171及TSPAN8不僅能作為區(qū)分肺癌組織與正常組織鑒別診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)于區(qū)分各種肺癌組織的亞型也具有較高的價(jià)值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這3種蛋白聯(lián)合應(yīng)用時(shí)診斷NSCLC的AUC可達(dá)0.74。目前對(duì)診斷篩查NSCLC外泌體蛋白雖有了一定的成就和較多的研究報(bào)道，但已篩選出的蛋白生物學(xué)標(biāo)志物尚需開(kāi)展進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證，相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，用于診斷NSCLC外泌體蛋白的標(biāo)志物將會(huì)被不斷被發(fā)現(xiàn)。

3.其余外泌體相關(guān)內(nèi)容物與NSCLC的診斷：外泌體中除miRNA、蛋白質(zhì)以外的其他分子如環(huán)狀RNA(circRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)也有望成為診斷NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞和組織中circRNA_0000735的表達(dá)量均明顯升高，且其表達(dá)與淋巴結(jié)浸潤(rùn)及TNM分期有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_0000735可顯著提高NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，又可明顯抑制癌細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能為circRNA_0000735與miR-1179/1182結(jié)合，從而發(fā)揮了生物學(xué)功能。另有一項(xiàng)研究顯示，SNHG6作為19個(gè)LAPro LncRs中的其中一個(gè)，在NSCLC患者血漿中的表達(dá)呈異常狀態(tài)，故可能作為NSCLC中肺腺癌的非侵入性檢測(cè)的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)志物[22]。

三、外泌體在NSCLC治療中的作用

近年來(lái)，外泌體所介導(dǎo)的治療肺癌的新方式備受青睞和關(guān)注。研究表明，外泌體及其相關(guān)成分對(duì)NSCLC的治療有著較高的應(yīng)用價(jià)值及較好的發(fā)展前景。

1.外泌體所介導(dǎo)的腫瘤疫苗的開(kāi)發(fā)：腫瘤疫苗是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，它是一種活性生物前體。當(dāng)NSCLC細(xì)胞相關(guān)抗原刺激抗原遞呈細(xì)胞時(shí)，樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生大量攜帶有特異性癌抗原的外泌體，隨著外泌體遷移到附近區(qū)域淋巴結(jié)便可激活產(chǎn)生強(qiáng)大抗腫瘤免疫反應(yīng)的CD4+和CD8+T的淋巴細(xì)胞[23]。有臨床研究證明，表皮生長(zhǎng)因子疫苗對(duì)NSCLC的治療具有較好的療效[24]。另外也有臨床試驗(yàn)證實(shí)，治療性疫苗(belagenpumatucel-L)對(duì)于NSCLC晚期患者來(lái)說(shuō)可適當(dāng)延長(zhǎng)其生存期[25]。因此對(duì)于NSCLC的治療，外泌體所介導(dǎo)的腫瘤疫苗可提供新的思路。

2.外泌體可抑制原癌基因表達(dá)：研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC相關(guān)原癌基因的表達(dá)可被外泌體有效抑制，從而對(duì)NSCLC的治療發(fā)揮作用。有研究報(bào)道，RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)的使用能使IGF-1R、AKT1、NUPR1、WT1等肺癌相關(guān)原癌基因保持沉默，并可加速NSCLC相關(guān)miRNA的降解[26，27]。因此，通過(guò)外泌體抑制NSCLC相關(guān)致癌基因的表達(dá)也將為NSCLC的預(yù)防和治療提供新的思路。

3.降低NSCLC細(xì)胞外泌體及其內(nèi)容物的含量：因NSCLC細(xì)胞分泌的外泌體及其內(nèi)容物在肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和演進(jìn)中發(fā)揮著重要作用，因此減少外泌體及其內(nèi)容物的含量或抑制NSCLC細(xì)胞對(duì)外泌體的分泌也可成為治療的新靶點(diǎn)。研究表明，NSCLC細(xì)胞分泌的外泌體能進(jìn)一步分泌生存素，其可有效促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制NSCLC細(xì)胞凋亡，生存素基因負(fù)性突變體(survivin-D53A)的使用可抑制NSCLC細(xì)胞分泌的外泌體分泌生存素，間接抑制了NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)了其凋亡，有望成為潛在的基因治療藥物。Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)，中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2) EPI64能有效抑制小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞相關(guān)外泌體的分泌，故EPI64可作為NSCLC治療的靶點(diǎn)。

4.外泌體可增強(qiáng)NSCLC患者對(duì)化療藥物的敏感度：也有一些研究證實(shí)外泌體可增強(qiáng)NSCLC患者對(duì)化療藥物的敏感度，如Aqil等[29]研究發(fā)現(xiàn)，裝載于外泌體中的植物萃取物雷公藤紅素能有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)可增強(qiáng)NSCLC患者對(duì)化療藥物的敏感度并減少毒性不良反應(yīng)。

四、展 望

隨著人們對(duì)外泌體不斷地探索和研究發(fā)現(xiàn)，其在NSCLC的診療等方面有著巨大的前景和臨床應(yīng)用價(jià)值，相信不久的將來(lái)便會(huì)廣泛地應(yīng)用于臨床，以達(dá)到延長(zhǎng)NSCLC患者生存時(shí)間和改善NSCLC患者生存率的目的。然而，如何尋找外泌體的靶基因、如何標(biāo)記、提取、分離和純化外泌體以及如何提高外泌體對(duì)NSCLC診斷和治療的特異性及敏感度等諸多問(wèn)題仍需廣大研究者不斷探究和解決。綜上所述，外泌體對(duì)NSCLC的診斷和治療擁有廣闊的前景，相信更多的外泌體研究成果能更有效、更精準(zhǔn)地應(yīng)用于臨床，以造福更多的NSCLC患者。