循環(huán)腫瘤細(xì)胞在大腸癌診療中的研究進(jìn)展

劉宏韜，周 黎綜述，何 松，周智航審校

0 引 言

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率逐年上升。據(jù)估算，2018 年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)約為184.95 萬(wàn)例，位居腫瘤發(fā)病率第3位，死亡例數(shù)為88.08 萬(wàn)例，位居腫瘤死亡率第2位[1]。目前大腸癌的篩查仍依賴(lài)于敏感性和特異性均不高的大便隱血及癌胚抗原(cancer embryonic antigen, CEA)等。此外，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是大腸癌治療失敗的主要原因，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。與獲取腫瘤組織樣本相比，通過(guò)患者血液樣本來(lái)檢測(cè)CTC更加容易，并可反復(fù)采集，是臨床上較為理想的標(biāo)本來(lái)源。研究表明，CTCs可應(yīng)用于大腸癌的預(yù)后、治療反應(yīng)以及腫瘤復(fù)發(fā)的檢測(cè)等重要環(huán)節(jié)，具有巨大的臨床應(yīng)用前景。需要注意的是，目前最常用的檢測(cè)CTC的方法是基于EpCAM等標(biāo)志物，存在檢出率較低、無(wú)法反映腫瘤異質(zhì)性等問(wèn)題，亟需更加高效、便捷的檢測(cè)方法。本文結(jié)合近來(lái)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，對(duì)大腸癌CTC相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 CTC的檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)全球已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量的技術(shù)來(lái)檢測(cè)特定的CTC，但是由于這些細(xì)胞在血流中具有極端的異質(zhì)性和罕見(jiàn)性，所以CTC的檢測(cè)技術(shù)仍然具有挑戰(zhàn)性，需要有更高靈敏度和特異性的方法來(lái)鑒定。CTC的檢測(cè)方法可以基于其生物學(xué)特性(即細(xì)胞表面標(biāo)記物)或物理特性(即大小、密度、電荷)，通常會(huì)與檢測(cè)技術(shù)(如免疫熒光、免疫組化、FISH)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)CTC[3]。CTC檢測(cè)的原理是依賴(lài)于分離腫瘤細(xì)胞中的正性富集或去除白細(xì)胞的負(fù)性富集。基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的方法中，最經(jīng)典的是CellSearch系統(tǒng)，它是目前唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)CTC的技術(shù)。 CellSearch系統(tǒng)通過(guò)EpCAM(上皮細(xì)胞黏附分子)包被的免疫磁珠在全血中捕獲CTC，然后使用抗細(xì)胞角蛋白(CK 8、CK 18、CK 19)、抗CD45(白細(xì)胞標(biāo)記物)和核染色(DAPI)進(jìn)行熒光檢測(cè)[4-8]。但這類(lèi)方法還是遺漏了發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或丟失EpCAM的細(xì)胞。

所以現(xiàn)在正在研究通過(guò)腫瘤細(xì)胞的物理特性來(lái)克服這種偏差。例如RosetteSep技術(shù)，去除血液中的白細(xì)胞后，在Ficoll-Paque PLUS密度梯度離心中分離得到CTC。ISET、ScreenCell以及我國(guó)的CanPatrol方法能夠使用微孔聚碳酸酯過(guò)濾器檢測(cè)CTC[9-10]，但是可能出現(xiàn)細(xì)胞堵塞等情況。近年來(lái)，基于微流控分離CTC成為新的熱點(diǎn)。微流控系統(tǒng)能夠根據(jù)細(xì)胞的大小、彈性等物理特性分離CTC，能夠有效反映CTC異質(zhì)性。例如CTC-iChip，它使用微流體去除紅細(xì)胞后，用EpCAM偶聯(lián)的微球正向富集CTC或用CD45抗體包被的微球負(fù)向富集CTC[11]。還有一些技術(shù)整合了多種方法，比如，DEPArray結(jié)合了微流系統(tǒng)和圖像分析系統(tǒng)選擇CTC[12-14]。上述每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性，而研究人員則可以根據(jù)CTC表型研究的具體目的，來(lái)確定CTC的捕獲方法。

2 CTC的診斷價(jià)值

CTC能在病程早期進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在CRC診斷過(guò)程中，通常需要檢測(cè)非特異性血清標(biāo)志物(CEA等)、內(nèi)鏡檢查和腹盆腔CT掃描。而這些非特異性血清腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CA19-9和CA72-4，已被認(rèn)為是CRC患者診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和指導(dǎo)治療的候選生物標(biāo)志物[15]。在HAIJIAO YU的一項(xiàng)研究中，對(duì)59例CRC患者檢測(cè)上述3種血清腫瘤標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)CEA的診斷靈敏度最高(50.85%)，其次是CA72-4(28.81%)和CA19-9(23.73%)[16]。然而CTC的診斷靈敏度為83.05%，顯著高于各種傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物和組合。聯(lián)合CTC和這3種生物標(biāo)志物時(shí)敏感性達(dá)到93.22%。其中CTC+CEA組合的敏感性(91.53%)僅略低于4種標(biāo)志物的聯(lián)合敏感性，結(jié)果表明CTC+CEA可能是CRC診斷和預(yù)后的血清腫瘤標(biāo)志物的有效組合。此外，作者觀察到腫瘤分期與CTC和腫瘤標(biāo)志物檢出率之間的相關(guān)性。作者在34.38%的Ⅰ～Ⅱ期CRC患者、53.33%的Ⅲ期患者和91.67%的Ⅳ期患者中檢出CTC，這些比率在所有病理分期均高于CA19-9和CA72-4的比例。此外，與正常個(gè)體相比，有78.13%的I-II期患者、86.67%的III期患者和91.67%的IV期的CRC患者觀察到CTC水平升高(≥2個(gè)/3.2 mL),這與癌癥不同分期的診斷敏感性升高相對(duì)應(yīng)。再者，聯(lián)合CTCs和CEA時(shí)，Ⅰ～Ⅱ期患者檢出率達(dá)到84.38%。

與其他生物標(biāo)志物例如ctDNA和外泌體相比，CTCs的診斷價(jià)值更有優(yōu)勢(shì)。首先，循環(huán)腫瘤細(xì)胞是從腫瘤中逃逸出來(lái)的具有活性的細(xì)胞，因此檢測(cè)其中突變，能夠大大降低人體細(xì)胞突變的背景噪音。其次，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌癥早期階段即存在，因此研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞能夠更為有效的實(shí)現(xiàn)癌癥的早篩。最后，目前大量的研究證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞是癌癥轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?，識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞上的標(biāo)靶進(jìn)行靶向治療，不僅能夠?qū)υ话?shí)現(xiàn)治療，也能大大減少癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。以上表明，CTCs是一種相對(duì)較好的疾病指標(biāo)，可用于CRC的早期診斷并判斷腫瘤分期，臨床上可將CTCs與 CEA相結(jié)合來(lái)提高特異性。

3 CTC與大腸癌預(yù)后的關(guān)系

由于剪切應(yīng)力和免疫監(jiān)視等生物和物理限制，絕大多數(shù)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞群都會(huì)死亡，小部分存活的CTCs(0.01%)卻能夠獲得成瘤能力[17-18]，形成轉(zhuǎn)移灶并重建腫瘤異質(zhì)性[19]。研究表明，CTCs對(duì)非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC預(yù)后的評(píng)估均有很高的價(jià)值。在非轉(zhuǎn)移性CRC中，CTCs的存在可以預(yù)測(cè)患者未來(lái)的轉(zhuǎn)移和較差的疾病結(jié)局。在轉(zhuǎn)移性CRC(metastatic colorectal cancer,mCRC)患者樣本中鑒定出CTC可能表明轉(zhuǎn)移病灶轉(zhuǎn)移的重新播散[20]。臨床數(shù)據(jù)表明，約20%(I期和II期)和30%(III期)的CRC患者在根治性手術(shù)后的5年內(nèi)復(fù)發(fā)[21]。這些觀察結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了術(shù)前或術(shù)中播散，隨后導(dǎo)致轉(zhuǎn)移形成[22]。非轉(zhuǎn)移性CRC患者血液中CTCs的存在可作為已經(jīng)存在的微轉(zhuǎn)移的替代標(biāo)志物，這些CTC具有較高的預(yù)后價(jià)值[23-24]。在CRC中使用CellSearh識(shí)別CTCs的研究表明，每7.5毫升血液中CTCs > 5的CRC患者預(yù)后更差，一年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高8倍[25]。另一項(xiàng)使用CellSearh系統(tǒng)的前瞻性研究，每7.5毫升血液中CTCs > 1的CRC患者預(yù)后更差[26]。最近的一項(xiàng)Meta分析(包括20項(xiàng)研究和超過(guò)3100例患者[27])證明,CTCs是CRC的一種有價(jià)值的預(yù)后因素。值得注意的是，Rahbari等[20]研究表明，在伴有肝轉(zhuǎn)移的mCRC患者肝靜脈血中CTC比外周靜脈血中多。CTC陽(yáng)性的mCRC患者(CTC > 3/7.5 mL血液)預(yù)后更差，無(wú)進(jìn)展生存期顯著降低，與非轉(zhuǎn)移性CRC的結(jié)果相似[28]。以上結(jié)果表明，CTC是一種預(yù)測(cè)CRC進(jìn)展和不良預(yù)后的有效手段，監(jiān)測(cè)治療前后CTC有助于預(yù)測(cè)預(yù)后，判斷術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)性。

4 CTC與大腸癌治療反應(yīng)的關(guān)系

CTC不僅作為診斷和預(yù)后標(biāo)志物，還可用作治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。Huang等[29]報(bào)道的一項(xiàng)Meta分析,發(fā)現(xiàn)CTC可用作預(yù)測(cè)CRC患者化療反應(yīng)的新型標(biāo)志物。在mCRC的臨床前試驗(yàn)中，CTC也可用作患者治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[30]?，F(xiàn)在臨床上大多數(shù)CRC患者以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)進(jìn)行化療。如果腫瘤為RAS野生型，則在這些方案中常規(guī)添加靶向藥物，如帕尼單抗和西妥昔單抗。然而，大多數(shù)腫瘤治療后會(huì)產(chǎn)生耐藥性。因此，轉(zhuǎn)移性CRC的治療決策取決于患者是否存在耐藥。據(jù)推測(cè)，與單獨(dú)的放射學(xué)監(jiān)測(cè)相比，CTC檢測(cè)可能會(huì)增加檢測(cè)靈敏度及早期檢測(cè)出治療耐藥性。一項(xiàng)研究表明，在III期CRC患者中輔助mFOLFOX后，CTC 持續(xù)陽(yáng)性是一個(gè)不良預(yù)后因素[31]。綜上所述，CTC可用于評(píng)估治療反應(yīng)。值得注意的是，CTCs在治療過(guò)程中EpCam 和細(xì)胞角蛋白等上皮標(biāo)記物會(huì)下調(diào)，來(lái)逃避檢測(cè)。通過(guò)CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在接受貝伐珠單抗治療的IV期乳腺癌患者中CTCs顯著下降，實(shí)際上這些患者出現(xiàn)了疾病進(jìn)展[32]。

5 結(jié) 語(yǔ)

近年的研究使CTCs在CRC患者中的臨床應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，現(xiàn)在可應(yīng)用于CRC的預(yù)后、治療反應(yīng)以及腫瘤復(fù)發(fā)的檢測(cè)等重要環(huán)節(jié)，CTCs作為液體活檢的一種形式，在促進(jìn)CRC患者實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)療方面具有巨大的潛力[33]。如今CTC已被FDA批準(zhǔn)用于CRC患者的疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。然而，CTCs檢測(cè)仍然面臨著重大挑戰(zhàn)。①檢測(cè)過(guò)程中需要克服CTC的罕見(jiàn)性和異質(zhì)性。CTC檢測(cè)方法眾多，每種方法都有自己的樣本制備、富集和分析的方案，但是仍無(wú)法完全克服這個(gè)問(wèn)題。②大多數(shù)研究是小型、單中心、病例對(duì)照研究，患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)差異很大，這使得驗(yàn)證研究非常困難。③目前的大多數(shù)研究結(jié)果均是基于CellSearch系統(tǒng)，如上所述，該系統(tǒng)檢出率低，可能漏掉了間質(zhì)型或不表達(dá)EpCAM的細(xì)胞。因此我們還是需要去研發(fā)一種具有高靈敏度和高特異性的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方案，用來(lái)捕獲全部的CTCs。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行更大樣本量的多中心、前瞻性研究明確CTC在大腸癌診療中的價(jià)值。此外，我們還需要通過(guò)測(cè)序、體外培養(yǎng)等方法明確CTC的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)特性，為開(kāi)發(fā)新的診斷及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。