豬偽狂犬病的檢測方法及疫苗應(yīng)用研究進(jìn)展

董政波，田 俊

(1.湖北省潛江市浩口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北 潛江 433100；2.湖北省潛江市竹根淮鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北 潛江 433101)

0 引言

豬偽狂犬病是在我國多地暴發(fā)并嚴(yán)重制約我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的疫病之一，導(dǎo)致新生仔豬大量死亡，母豬屢配不孕，妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等，育肥豬生長緩慢等，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的沖擊。近幾年該病在我國有抬頭傾向，也在臨床上有加重趨勢，可能與疫苗使用不當(dāng)有關(guān)，因此，在實(shí)際養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，要重視疫苗的使用問題。

1 豬偽狂犬病簡介

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的以母豬繁殖障礙、育肥豬呼吸障礙和生長緩慢以及仔豬高死亡率等為主要臨床特征的病毒性傳染病[1]，影響豬群的正常生長發(fā)育。雖然該病有多種易感動物，包括豬、牛、綿羊、犬、貓、肉食動物等，但是豬是其天然宿主和重要傳染源，并且豬受感染不分品種、性別和年齡，尤以哺乳仔豬感染最嚴(yán)重，發(fā)病死亡率為100%。病毒可通過多種途徑感染健康豬群，如通過病豬的口腔和鼻腔分泌物及呼吸道飛沫排出體外；被病毒污染的飼料和器具、帶病毒的豬、鼠等動物。此病的流行有一定的季節(jié)性，在寒冷季節(jié)多發(fā)，但其他季節(jié)也發(fā)生過病例。

偽狂犬病毒的致病機(jī)理是其可通過空氣進(jìn)入宿主的呼吸系統(tǒng)，并隨著血液流動擴(kuò)散至全身，病毒經(jīng)過嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)入侵中樞神經(jīng)，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[2]。

2 豬偽狂犬病的檢測方法

可以根據(jù)疾病的臨床癥狀和流行病學(xué)，對疫病做出初步診斷，但是確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。常見的檢測方法有病毒分離鑒定、PCR技術(shù)、熒光抗體染色技術(shù)和血清學(xué)檢測。

2.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是診斷豬偽狂犬病的可靠方法?？晒┻x擇的病料組織包括腦、腎、扁桃體、肝、脾、肺、心等多種組織以及鼻咽分泌物，但以腦組織和扁桃體最為理想。病料處理后可直接接種雞胚成纖維細(xì)胞、豬腎傳代細(xì)胞、倉鼠腎傳代細(xì)胞等敏感細(xì)胞。接種后觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)典型病變。若初次接種無細(xì)胞病變，可盲傳3代。分離到病毒后再用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做中和試驗(yàn)以確診本病。

2.2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是利用PCR從病豬的分泌物如鼻咽拭子或組織病料中擴(kuò)增豬偽狂犬病病毒的基因，從而對患病動物進(jìn)行確診。與病毒分離鑒定相比，該方法具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能同時檢測大批量的樣品，并且能進(jìn)行活體檢測，適合于臨床診斷。但是該技術(shù)的特異性受其他因素的影響，如引物設(shè)計不合理等，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

2.3 熒光抗體染色技術(shù)

該方法是利用熒光素對抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，再用熒光顯微鏡對標(biāo)記抗原或抗體追蹤并分析。方法是取患病動物的病料如腦或扁桃體的壓片或冰凍切片，通過直接免疫熒光進(jìn)行檢查。雖然具有檢測快速、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性不強(qiáng)，且檢測育肥豬與成年豬不如病毒分離敏感。

2.4 血清學(xué)檢測

多種血清學(xué)方法都可用于豬偽狂犬病的診斷，其中應(yīng)用較廣泛的有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及間接免疫熒光等。首先，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有簡單快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，3～4 h可得出試驗(yàn)結(jié)果，可以同時檢測大批量樣品，是檢測豬偽狂犬病的首選。其次，血清中和實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性都是最好的，且結(jié)果容易判斷，但是其對技術(shù)條件的要求高、時間長、靈敏度不高，所以很難用于大量實(shí)踐，主要是用于實(shí)驗(yàn)室研究。乳膠凝集實(shí)驗(yàn)以操作極其簡便快速的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)也得以廣泛應(yīng)用。

3 疫苗免疫失敗原因

在豬場中存在著疫苗接種失敗的問題，追其原因有母豬跟胎免疫、疫苗選擇不當(dāng)、新生仔豬不滴鼻或滴鼻后不肌注、不使用滴鼻器以及8～12周齡的育成豬和成年豬未進(jìn)行第3次免疫等[3]。這些原因都會導(dǎo)致疫苗接種的效果不佳，浪費(fèi)疫苗成本。因此只有加強(qiáng)母豬免疫，增強(qiáng)母源抗體保護(hù)才能保證仔豬安全。而且疫苗購買后應(yīng)冷藏保存，最好于-20℃保存。如果疫苗稀釋了必須在當(dāng)日用完。另外，不得給有病、體弱或剛閹割的豬注射疫苗。

4 疫苗應(yīng)用情況

疫苗免疫接種是控制豬偽狂犬病的重要措施，雖然早期的滅活疫苗和弱毒疫苗能起一定的防控作用，但是它們存在一定的缺陷，比如滅活疫苗有免疫效率低、不能將內(nèi)源性蛋白抗原呈遞給免疫系統(tǒng)、偶有過敏反應(yīng)、對動物健康造成風(fēng)險的問題；雖然弱毒疫苗的免疫原性好且價格低廉，但是安全性差，即疫苗毒株有一定的毒力，存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險。因此，為了防止偽狂犬病毒的感染，國內(nèi)外研究學(xué)者研制出了很多基因工程疫苗，有基因缺失疫苗、亞單位疫苗、基因重組載體疫苗、核酸疫苗，其中基因缺失弱毒疫苗已經(jīng)相對成熟并得到應(yīng)用，在歐洲和美國等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的豬偽狂犬病的預(yù)防中起著重要的作用，但是其他基因工程疫苗還在研究中。

基因缺失疫苗是研究的熱點(diǎn)之一，缺失的基因主要集中在TK、gG、gE、gB、gC、gD、gI等毒力基因和部分囊膜糖蛋白。而且已構(gòu)建出了多種基因缺失疫苗，包括單基因疫苗(TK基因缺失的BUK-dl3疫苗株)、雙基因疫苗(在BUK-dl3株基礎(chǔ)上構(gòu)建的TK/gC雙基因缺失疫苗株)和多基因疫苗(gC/gE/gI/gG和gD/gE/gI/gG四基因缺失疫苗株)。但是因?yàn)樨i狂犬病毒的變異，導(dǎo)致這些疫苗的免疫力無法抵抗變異毒株的攻擊，免疫力不足，因此，研究人員又開始研制流行變異株的基因缺失疫苗，這類疫苗可產(chǎn)生特異性抗體，完全應(yīng)對新型毒株的攻擊。如果研制成功，將對豬偽狂犬病的預(yù)防和控制具有很大的助力作用。

5 展望

近幾年，奧地利、德國和美國等國家實(shí)施了全國性的豬偽狂犬病消除計劃并實(shí)現(xiàn)了凈化。我國目前還沒有完全消除該病。無法根除的原因包括我國還沒建立系統(tǒng)的生物安全體系、疫苗接種制度和綜合防疫措施等，并且單純依靠疫苗接種也達(dá)不到清除該病的目的，需要結(jié)合系統(tǒng)性的篩查—淘汰—免疫—檢疫—隔離—持續(xù)監(jiān)測—凈化等措施。這既需要國家制定嚴(yán)格且規(guī)范的制度，管理者制定嚴(yán)格的管理制度，也需要從業(yè)者提高素質(zhì)，提高防疫意識和能力，共同努力達(dá)到全國性清除該病的目標(biāo)。

6 結(jié)語

豬偽狂犬病病毒的不斷變異增大了我國控制和根除疫病的難度。因此，研制當(dāng)前流行變異毒株的新型疫苗仍然是努力的方向。此外，還要建立嚴(yán)格的疫苗接種程序、飼養(yǎng)管理制度、生物安全措施等，進(jìn)一步降低豬群感染疫病的概率，進(jìn)而助力豬偽狂犬病的凈化和根除。