黨參發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種篩選及發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分研究

黎氏大芳，張涵雪，高英鑫，楊雪晴，邱智東，徐 偉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林長(zhǎng)春·130117）

黨參Codonopsis pilosula(Franch.）Nannf.為桔?？贫嗄晟荼局参?，清代《本草正義》記載黨參具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃，潤(rùn)肺生津，健運(yùn)中氣的功能。現(xiàn)代藥理研究表明，黨參藥理作用廣泛，對(duì)人體循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用[1]，主要用于脾肺氣虛，食少倦怠，咳嗽虛喘，氣血不足等[2]。黨參主要含有糖類、生物堿類、聚炔類、苷類及萜類等化學(xué)成分[3-9],具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[10]。中藥生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)，具有安全性高、投資少、周期短、反應(yīng)條件溫和、穩(wěn)定可控以及綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，可以作為一種有效方法應(yīng)用于中藥創(chuàng)新，已經(jīng)成為中藥產(chǎn)業(yè)新的增長(zhǎng)點(diǎn)。本研究利用13種藥用真菌，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)黨參進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)黨參發(fā)酵情況，確定靈芝菌為黨參發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種。進(jìn)一步對(duì)黨參優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到5個(gè)化合物，分別是香草醛（1）、豆甾醇（2）、β-谷甾醇（3）、5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇（4）和9,12-cyclomulin-13-醇（5）?；衔?-5的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DNP-9082BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YSQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LC-2130型日立高效液相色譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；AVANCEⅢ600傅里葉變換核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；KQZ3200E型超聲波清洗機(jī)（天鵬電子新技術(shù)有限公司）。

1.2 材料

黨參藥材（批號(hào)：26018044）購(gòu)于吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為桔?？泣h參屬黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥飲片；牛肝菌、木耳菌、香菇、平菇、杏鮑菇、大青菇、白靈菇、樹(shù)雞、樹(shù)舌、云芝、靈芝、灰樹(shù)花、白樹(shù)花（中科院微生物所）；柱色譜硅膠（100～200目，批號(hào)：0140027，青島海洋化工有限公司）；ODS-C18填料（北京綠百草科技發(fā)展有限公司）；AM12S05-3010WT YMC-Pack ODS-AM半制備色譜柱（300 mm×10 mm，粒徑：5μm，日本YMC公司）；所用試劑均為分析純，由北京化工廠提供；液相用水為娃哈哈純凈水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黨參發(fā)酵

2.1.1 種子液的制備

按照營(yíng)養(yǎng)型培養(yǎng)基配方（葡萄糖2%，酵母粉0.2%，硫酸鎂0.1%，蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%），在自然pH條件下制備液體培養(yǎng)基，接種牛肝菌、木耳菌、香菇、平菇、杏鮑菇、大青菇、白靈菇、樹(shù)雞、樹(shù)舌、云芝、靈芝、灰樹(shù)花、白樹(shù)花菌絲，28±1℃培養(yǎng)至產(chǎn)生大量均一菌球。

2.1.2 菌種培養(yǎng)

將13種藥用真菌菌球接入粉碎滅菌的黨參藥材中，28±1℃，65%RH避光培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

2.1.3 結(jié)果分析

通過(guò)表1可見(jiàn)，利用牛肝菌、大青菇、樹(shù)雞、香菇、灰樹(shù)花和白樹(shù)花未能發(fā)酵黨參；利用白靈菇、樹(shù)舌發(fā)酵黨參，第2周發(fā)酵停止，且未發(fā)酵完全；利用木耳菌、杏鮑菇、平菇發(fā)酵黨參，第3周發(fā)酵停止，且未發(fā)酵完全；利用云芝、靈芝發(fā)酵黨參均能發(fā)酵完全，靈芝與云芝相比生長(zhǎng)趨向于瓶底，生長(zhǎng)狀態(tài)更為旺盛，故確定靈芝菌為黨參發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種。

2.2 化學(xué)成分研究

2.2.1 提取分離

選擇黨參靈芝發(fā)酵產(chǎn)物5.0kg，7倍量70%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮得到稠膏。稠膏與適量水混懸后依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取3次，分別得到石油醚部位65g、乙酸乙酯部位51g、水飽和正丁醇部位245g。

取乙酸乙酯部位浸膏，經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶10、100∶20、100∶50，V/V）梯度洗脫，得到54個(gè)流分，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)后合并得到14個(gè)組分。其中，第2組分經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到化合物1；第12組分經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到化合物2、3；第12組分經(jīng)硅膠柱色譜后，再經(jīng)半制備液相70%甲醇洗脫得到化合物4；第13組分經(jīng)半制備液相85%甲醇洗脫得到化合物5。

2.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，分子式C8H8O3。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ3.91（3H,s,-OCH3），6.91（1H,d,J=9.0Hz,H-5），7.42（1H,d,J=2.4Hz,H-2），7.42（1H,dd,J=2.4,7.8Hz,H-6），9.70（1H,s,H-7）。13C-NMR（CD3OD,150 MHz）:δ129.7（C-1），110.9（C-2），149.4（C-3），154.7（C-4），116.4（C-5），128.1（C-6），192.5（C-7），56.1（-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致，結(jié)合理化性質(zhì)，故鑒定化合物1為香草醛。

化合物2：白色粉末，分子式C29H48O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ1.05（3H,s,H-18），1.30（3H,s,H-19），2.37（2H,t,J=7.5Hz,H-7），2.80（2H,t,J=13.2Hz,H-4），3.62（1H,m,H-3），5.17（2H,m,H-22,H-23），5.18（1H,m,H-6）。13C-NMR（CDCl3,150 MHz）:δ38.2（C-1），31.7（C-2），71.3（C-3），41.1（C-4），139.8（C-5），117.7（C-6），34.4（C-7），34.4（C-8），49.7（C-9），36.8（C-10），21.3（C-11），39.8（C-12），40.7（C-13），56.3（C-14），24.9（C-15），28.7（C-16），55.4（C-17），12.3（C-18），19.9（C-19），40.5（C-20），21.6（C-21），138.3（C-22），129.7（C-23），51.5（C-24），32.1（C-25），21.8（C-26），19.2（C-27），25.6（C-28），13.3（C-29）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的基本一致，結(jié)合理化性質(zhì)，故鑒定化合物2為豆甾醇。

化合物3：白色粉末，分子式C29H50O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ1.04（3H,s,H-18），1.27（3H,s,H-19），2.37（2H,t,J=7.5Hz,H-7），2.80（2H,t,J=13.2Hz,H-4），3.62（1H,m,H-3），5.37（1H,m,H-6）。13C-NMR（CDCl3,150 MHz）:δ37.4（C-1），31.7（C-2），71.3（C-3），41.1（C-4），139.8（C-5），117.7（C-6），34.1（C-7），34.1（C-8），49.7（C-9），36.8（C-10），21.3（C-11），39.7（C-12），40.7（C-13），56.1（C-14），23.2（C-15），28.2（C-16），55.3（C-17），12.3（C-18），19.9（C-19），36.4（C-20），19.1（C-21），33.9（C-22），26.4（C-23），46.1（C-24），29.9（C-25），20.0（C-26），19.2（C-27），23.2（C-28），12.1（C-29）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的基本一致，結(jié)合理化性質(zhì)，故鑒定化合物3為β-谷甾醇。

化合物4：白色粉末，分子式C27H44O4。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ0.89（6H,s,H-20,H-21），0.90（3H,m,H-27），3.65（1H,m,H-1），3.79（1H,m,H-16），3.85（2H,m,H-26），3.97（1H,m,H-3）。13C-NMR（CD3OD,150 MHz）:δ73.0（C-1），38.9（C-2），64.6（C-3），34.9（C-4），37.1（C-5），26.9（C-6），30.6（C-7），32.2（C-8），54.8（C-9），40.8（C-10），23.9（C-11），40.3（C-12），39.2（C-13），56.0（C-14），30.9（C-15），79.2（C-16），62.3（C-17），43.2（C-18），113.0（C-19），17.8（C-20），14.6（C-21），14.3（C-22），30.3（C-23），27.6（C-24），28.2（C-25），64.5（C-26），6.5（C-27）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的基本一致，結(jié)合理化性質(zhì)，故鑒定化合物4為5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇。

化合物5：白色粉末，分子式C20H34O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ0.60（1H,m,H-12），0.72（2H,dd,J=4.8,9.2Hz,H-11），0.82（3H,d,J=6.1Hz,H-18），0.89（3H,d,J=6.1Hz,H-19），1.06（1H,s,H-3），1.32（3H,s,H-16），1.34（1H,s,H-4），2.18（1H,dd,J=16.0,7.8Hz,H-10）。13CNMR（CD3OD,150MHz）:δ20.7（C-1），28.7（C-2），60.8（C-3），31.0（C-4），41.3（C-5），34.1（C-6），38.7（C-7），29.4（C-8），26.2（C-9），48.2（C-10），10.7（C-11），26.1（C-12），69.9（C-13），30.9（C-14），35.6（C-15），29.1（C-16），25.3（C-17），22.3（C-18），22.2（C-19），18.7（C-20）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的基本一致，結(jié)合理化性質(zhì)，故鑒定化合物5為9,12-cyclomulin-13-醇。

3 討論

利用生物轉(zhuǎn)化的方法處理中藥，是發(fā)掘新的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，具有中國(guó)特色的天然高活性先導(dǎo)化合物的重要途徑。根據(jù)中藥材選擇特定的發(fā)酵菌種尤為重要，不同菌種在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生特定的酶或類酶物質(zhì)，使原有成分發(fā)生不同的氧化、水解、重排反應(yīng)，從而改變?cè)谢瘜W(xué)成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進(jìn)而改變中藥材原有的功效。本研究選擇“3+1優(yōu)化法”中初選、復(fù)選方法對(duì)黨參發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行篩選，確定了靈芝菌為黨參發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種，并從黨參靈芝菌發(fā)酵產(chǎn)物中首次分離得到5個(gè)化合物，分別是香草醛（1）、豆甾醇（2）、β-谷甾醇（3）、5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇（4）、9,12-cyclomulin-13-醇（5），其中化合物4、5在黨參原藥材中未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為黨參經(jīng)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。本研究為黨參生物發(fā)酵及其產(chǎn)物的物質(zhì)成分研究奠定了基礎(chǔ)。