嬰幼兒鞋類產(chǎn)品橡膠部件中N-亞硝基胺假陽性的鑒別

周蓉 朱小芳 林東翔 陸婷婷 李燕

南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 江蘇南京 210000

嬰幼兒鞋是指鞋號(hào)不大于170mm，3周歲以下嬰幼兒穿著的鞋。強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn) GB30585《兒童鞋安全技術(shù)規(guī)范》中要求，嬰幼兒鞋橡膠部件中不應(yīng)檢出N-亞硝基胺。我國(guó)另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn) GB25036-2010《布面童膠鞋》和GB25038-2010《膠鞋健康安全技術(shù)規(guī)范》，也規(guī)定嬰幼兒鞋橡膠部件中N-亞硝基胺不得檢出[1]。亞硝基胺化合物是具有-N-N=O官能團(tuán)物質(zhì)的總稱，是一類很強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)。在已發(fā)現(xiàn)的300多種N-亞硝基胺化合物中，約有90%能使40種受試動(dòng)物發(fā)生腫瘤[2]。

目前嬰幼兒鞋類產(chǎn)品橡膠部件中N-亞硝基胺的檢測(cè)依據(jù)是GB/T24153-2009《橡膠及彈性體材料 N-亞硝基胺的測(cè)定》，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的儀器是氣質(zhì)聯(lián)用儀[3]。氣質(zhì)聯(lián)用法具有選擇性好，靈敏度高，可直接用質(zhì)譜定性等優(yōu)點(diǎn)，但此方法也具有一定的局限性。氣質(zhì)聯(lián)用法是根據(jù)各組分流經(jīng)色譜柱后的保留時(shí)間，質(zhì)核比信息與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行匹配達(dá)到定性的目的，對(duì)于分子量相同化學(xué)性質(zhì)相似的物質(zhì)就很難達(dá)到很好的分離效果[4-5]。且氣質(zhì)聯(lián)用法需要對(duì)樣品進(jìn)行高溫氣化處理，因此進(jìn)樣口溫度很高，部分N-亞硝基胺會(huì)出現(xiàn)分解現(xiàn)象，從而生成新的N-亞硝基胺物質(zhì)，易出現(xiàn)假陽性的問題。目前國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于N-亞硝基胺檢測(cè)假陽性分析的文章，本研究旨在建立一種對(duì)嬰幼兒鞋類產(chǎn)品橡膠部件中N-亞硝基胺檢測(cè)結(jié)果假陽性的快速篩查的方法，提高檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

儀器：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀5977A/7890B、1260Infinity II超高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）；XS204電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）（TEDIA試劑有限公司）；NMPhA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、NMPhA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、MPhA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、EPhA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取每種N-亞硝基胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.10g（精確至0.1mg），用甲醇定容至100ml容量瓶中，配制成濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，備用。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 氣質(zhì)連用分析條件

毛細(xì)管柱：HP-5ms UI Inert（30m×250μm×0.25μm）；程序升溫：柱溫38℃，保持4min；以8℃/min的速率升溫至83℃，保持4min；15℃/min的速率升溫至300℃，保持6min；載氣：氦氣≥99.999%；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣口溫度：260℃；質(zhì)譜接口溫度：280℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.2 高效液相分析條件

色譜柱：Eclipse XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：水=65：35（體積比）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣質(zhì)聯(lián)用法的鑒別

分別配制50mg/L的NMPhA、MPhA、NEPhA和EPhA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用的方法進(jìn)行測(cè)試

2.2 色譜柱型號(hào)對(duì)假陽性的影響

考察了弱極性色譜柱HP-5ms UI Inert（30m×0.25mm×0.25μm）和強(qiáng)極性色譜柱DB-WAX（30m×0.25mm×0.25μm）兩種不同極性的色譜柱對(duì)NMPhA和NEPhA兩種單標(biāo)分離的影響。結(jié)果表明：在兩種色譜柱中都出現(xiàn)了兩個(gè)峰形尖銳的兩個(gè)色譜峰，且其他并無響應(yīng)面積能夠匹配的雜峰出現(xiàn)，說明應(yīng)是這兩種N-亞硝基胺峰；但經(jīng)過質(zhì)譜確認(rèn)發(fā)現(xiàn)在兩種色譜柱中出現(xiàn)的兩個(gè)色譜峰定性的結(jié)果均是MPhA和EPhA。說明在2.3.1的條件下，NMPhA和NEPhA 完全分解為MPhA和EPhA，HP-5ms UI Inert和DB-WAX兩種色譜柱對(duì)N-亞硝基胺產(chǎn)生假陽性的結(jié)果沒有直接的關(guān)系，通過色譜柱的優(yōu)化不能夠解決假陽性的問題。

2.3 進(jìn)樣口溫度對(duì)假陽性的影響

按照2.3.1中的條件，HP-5ms UI Inert為色譜柱，選擇對(duì)上述四種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明：NMPhA和MPhA的出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖完全一樣，NEPhA和EPhA的出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖也完全一樣，證明了按照GB/T24153標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的進(jìn)樣口溫度為260℃時(shí)NMPhA和NEPhA完全分解為MPhA和EPhA。說明標(biāo)準(zhǔn)GB/T24153-2009《橡膠及彈性體材料 N-亞硝基胺的測(cè)定》的測(cè)試條件對(duì)于對(duì)NMPhA和NEPhA兩種N-亞硝基胺的檢測(cè)并不適用，在實(shí)際樣品檢測(cè)過程中，會(huì)造成假陽性的分析結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

為進(jìn)一步研究進(jìn)樣口溫度對(duì)NMPhA和NEPhA檢測(cè)結(jié)果的影響，將進(jìn)樣口溫度分別設(shè)置為100℃、120℃、150℃、180℃、200℃，220℃、240℃、260℃，測(cè)試結(jié)果：

由圖1、2可以看出，NMPhA會(huì)在高溫下逐漸分解為MPhA，NEPhA在高溫下逐漸分解為EPhA。為了獲得最佳的進(jìn)樣口溫度，避免檢測(cè)過程中出現(xiàn)假陽性，我們分別測(cè)試了在進(jìn)樣口溫度分別為100℃、120℃、150℃、180℃、200℃、220℃、240℃和260℃的條件下，NMPhA、NEPhA兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分解情況。結(jié)果見表圖3。

圖1 進(jìn)樣口220℃時(shí)NMPhA和MPhA色譜圖

圖2 進(jìn)樣口200℃時(shí)NEPhA和EPhA色譜圖

圖3 不同進(jìn)樣口溫度下NMPhA、NEPhA的峰面積折線圖

對(duì)于NMPhA，從圖3中可以看出，進(jìn)樣口溫度在100-180℃時(shí)，NMPhA的峰面積隨著溫度的升高不斷增加，分解物MPhA的峰面積為零；當(dāng)溫度超過180℃之后，NMPhA的峰面積隨著溫度的增加不斷減少，分解物MPhA的峰面積不斷增加；當(dāng)溫度達(dá)到260℃時(shí)，NMPhA峰面積為零，分解物NMPhA峰面積達(dá)到最大值。

這是由于當(dāng)溫度較低時(shí)，NMPhA不能完全氣化進(jìn)入色譜柱被檢測(cè)到信號(hào)，NMPhA峰面積響應(yīng)較小；當(dāng)溫度達(dá)到180℃時(shí)，NMPhA剛好能完全氣化進(jìn)入色譜柱，此時(shí)NMPhA峰面積響應(yīng)達(dá)到最大；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，NMPhA開始逐漸分解為MPhA，因此NMPhA的峰面積不斷降低，而分解物MPhA的峰面積不斷增加；當(dāng)溫度達(dá)到260℃時(shí)，NMPhA完全分解為MPhA，此時(shí)NMPhA無響應(yīng)，峰面積為零，而分解物NMPhA峰面積達(dá)到最大值。

對(duì)于NEPhA，趨勢(shì)和NMPhA基本一致。進(jìn)樣口溫度在100-180℃時(shí)，NEPhA的峰面積隨著溫度的升高不斷增加；當(dāng)溫度超過180℃之后，NEPhA的峰面積隨著溫度的增加不斷減少，分解物EPhA的峰面積不斷增加；當(dāng)溫度達(dá)到240℃時(shí)，NEPhA基本完全分解，峰面積為零。

根據(jù)上述分析，當(dāng)溫度達(dá)到180℃時(shí)，NMPhA和NEPhA能夠完全氣化進(jìn)入檢測(cè)器而不產(chǎn)生分解，峰面積響應(yīng)達(dá)到最大值，選擇180℃為最佳的進(jìn)樣口溫度。

2.4 高效液相法的鑒別

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)NMPhA、MPhA、NEPhA 、EPhA四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行紫外光譜全波長(zhǎng)掃描，這類物質(zhì)在220-380nm范圍內(nèi)均具有較高的吸光度。

實(shí)驗(yàn)可知，NMPhA和MPhA的最大特征吸收波長(zhǎng)不同，NMPhA在270nm處有強(qiáng)吸收，MPhA在240nm處有強(qiáng)吸收。為了更好的定性定量NMPhA，優(yōu)先選擇270nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NEPhA的光譜掃描結(jié)果與NMPhA類似，EPhA的光譜掃描結(jié)果與NMPhA類似，綜合考慮選擇270nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈/水、甲醇/水兩種流動(dòng)相對(duì)NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA四種物質(zhì)的的分離效果。結(jié)果表明，兩種流動(dòng)相均能夠?qū)ι鲜鏊姆N物質(zhì)進(jìn)行分離。由于乙腈的淋洗能力較強(qiáng)，出峰時(shí)間短，四種物質(zhì)的分離效果不如甲醇，且標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理萃取溶劑為甲醇，因此綜合考慮選擇甲醇/水作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇：水為65:35（體積比）時(shí)，在此條件下出峰時(shí)間較短，峰形完整，四種物質(zhì)能夠有效分離。

在上述優(yōu)化色譜條件下，對(duì)濃度為1.0mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，圖4是四種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下可以有效分離四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中NMPhA和NEPhA保留時(shí)間分別為4.320min和5.555min，MPhA和EPhA的保留時(shí)間分別4.707min和6.334min。因此通過高效液相法可以解決嬰幼兒鞋橡膠部件中N-亞硝基胺氣質(zhì)檢測(cè)中出現(xiàn)假陽性的問題[6]。

圖4 NMPhA、NEPhA、MPhA和EPhA液相色譜圖

3 結(jié)語

本文建立了嬰幼兒鞋類產(chǎn)品橡膠部件中N-亞硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）和N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）兩種N-亞硝基胺假陽性的鑒別方法。探討了檢測(cè)過程中產(chǎn)生假陽性的原因，提出如何避免在檢測(cè)過程中假陽性出現(xiàn)的方法。

對(duì)于氣質(zhì)聯(lián)用法，本研究選擇180℃作為最佳進(jìn)樣口溫度，避免NMPhA和NEPhA兩種物質(zhì)因高溫分解而產(chǎn)生假陽性。對(duì)于高效液相法，本研究選擇270nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，甲醇/水（65:35）為流動(dòng)相，高效準(zhǔn)確的分離NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA四種物質(zhì)，避免產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。并通過兩種方法的比較和分析，增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免檢測(cè)過程中出現(xiàn)假陽性而影響檢測(cè)結(jié)果的可信度。