大花鐵線蓮花芽分化及花器官發(fā)育特性1)

李海微 張永勝 王非

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

目前，我國園林綠化植物資源豐富，但高寒地區(qū)可用于垂直立體綠化的藤本植物資源有限，種類單一[1]。鐵線蓮屬植物具有花期長，適應(yīng)性強和較高的觀賞性，被譽為“攀緣植物皇后”[2]。大花鐵線蓮因花朵碩大、花色豐富、耐寒耐旱，而常常用于柵欄、屋頂花園、廊架以及亭子的綠化點綴[3]。作為東北地區(qū)固有的野生藤本資源，大花鐵線蓮兼具較高的觀賞特性和抗性，是垂直綠化的優(yōu)良材料。故本試驗選用大花鐵線蓮進行研究，一方面開發(fā)對野生資源的園林利用，充分發(fā)揮其生態(tài)效益和觀賞價值；另一方面也可以擴大高寒地區(qū)垂直綠化應(yīng)用的藤本植物種類的選擇。

花芽分化是植物開花生物學(xué)的重要特征之一，而雌雄配子體的發(fā)育是花芽分化的一個延續(xù)過程。其過程的研究對于花期調(diào)控、提高植物開花數(shù)量和質(zhì)量以及植物的遺傳育種工作開展具有重要的意義[4-7]。目前，對大花鐵線蓮的研究主要集中在花部特征、花粉活力、繁育系統(tǒng)等方面[8-9]?；ㄑ糠只矫娴难芯旷r有，僅限于大花鐵線蓮3個花被類型的重被花起源方式的探索試驗上[10]，且并未對大花鐵線蓮生殖生物學(xué)方面進行探討。因此，本試驗針對大花鐵線蓮的野生栽培種的花芽分化過程進行觀測和分析，同時在雌雄配子體發(fā)育方面進行了探索和研究，從而為大花鐵線蓮的花期調(diào)控和雜交育種等方面研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗材料是從吉林省引至哈爾濱栽培了3年的大花鐵線蓮(Clematispatens)。試驗地點為黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實驗室內(nèi)進行，試驗時間為2017年4月份至2018年6月份。

花芽采集的時間為4—6月上旬。材料每5 d進行1次采集(在花芽日變化不顯著時)，或者每2 d取材1次(花芽變化較快的時期)。材料采集之后立即用FAA固定液進行固定，于冰箱中4°固定24 h以上，之后放到酒精中進行保存。

于2017年4月底至6月初，每隔3 d，于每日08:00—10:00進行頂生單花的采集，將各個發(fā)育時期的大小各異的雌雄花蕾采集過后用FAA固定液固定并進行保存。

采用常規(guī)石蠟法進行制片。用LEICA RM 2255切片機將材料切割成若干個薄片，薄片的厚度8～10 μm。然后，用番紅對薄片進行染色，中性樹膠封片，最后將封制好的材料放在LEICA DM 2255顯微鏡下觀察和拍攝。從材料采集到圖片拍攝，需要試驗的反復(fù)操作，直至得到該生長期的圖像，重復(fù)圖像擇優(yōu)。應(yīng)用Excel 2007和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花鐵線蓮花芽分化過程

如圖1所示，大花鐵線蓮花芽分化分5個時期，即營養(yǎng)生長期、花芽分化初期、萼片原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期。大花鐵線蓮4月下旬便開始萌動進行營養(yǎng)生長，萌動5～7 d時花芽開始分化，大花鐵線蓮花芽分化主要是發(fā)生在頂芽，但是也存在一些發(fā)生在葉腋的特殊情況(圖1T)，這種特殊情況是極少存在的。在5月中旬左右，大花鐵線蓮進入開花期，6月上旬開始結(jié)實，在這期間花芽分化繼續(xù)進行，為群體花期的延長提供了途徑。

營養(yǎng)生長期：大花鐵線蓮在植株萌動后開始營養(yǎng)生長，此時生長錐細胞體積較小、排列整齊且分裂旺盛，整個生長錐頭部較尖(圖1A)。在外觀上，大花鐵線蓮頂芽幼嫩，且外層包被多層葉芽，體積較小。

花芽分化初期：在分化初期，細胞體積變大，排列整齊(圖1B)，生長錐的橫縱莖顯著變長，其營養(yǎng)生長錐漸漸發(fā)展成闊圓、平坦的形狀，細胞核較為明顯。

花萼原基分化期：營養(yǎng)生長錐在此時期繼續(xù)生長，與此同時，花原基的兩側(cè)逐漸分化出萼片原基，形似兩個對稱的突起(圖1C)。隨后萼片原基內(nèi)細胞不斷分裂，萼片原基分化為萼片，逐漸包住萼片內(nèi)部的花芽原基(圖1D-G)。

雄蕊原基分化期：隨著花萼原基的不斷生長，大花鐵線蓮生殖生長錐也在生長，體積變大(圖1H)。細胞繼續(xù)分裂，生殖生長錐基部兩側(cè)細胞分裂旺盛且排列緊密(圖1I)，隨后分化出雄蕊原基(圖1J)，發(fā)育的順序是由下而上呈中心對稱進行的(圖1J-P)。雄蕊原基不斷生長分化，最終生長為花藥和花柱，花藥里面分化出花粉，花粉在花粉囊內(nèi)產(chǎn)生(圖1U)。

雌蕊原基分化期：雄蕊原基呈現(xiàn)“向心型”發(fā)育，當雄蕊發(fā)育到最后一輪的時候，雌蕊原基同時發(fā)生分化過程，雌蕊原基主要發(fā)生在生長錐的頂部平滑的位置。隨著雌蕊原基不斷分化，數(shù)量越來越多(圖1Q-S)。與此同時，大花鐵線蓮生長錐的體積也在不斷縮小。雌蕊原基最終分化為雌蕊，結(jié)構(gòu)為倒生胚珠及其他附屬結(jié)構(gòu)(圖1V)。

2.2 花芽縱橫長度數(shù)量變化

在花芽分化的過程中，花芽的形態(tài)在發(fā)生著變化，同時花芽的體積和數(shù)量關(guān)系也在發(fā)生著變化，花芽在不同的分化階段橫縱長度有所變化(表1)?；ㄑ繖M長先變短后變長，到雌蕊原基分化期達到了最大值，平均為553 μm，從萼片原基到雄蕊原基增長速度最快，增長了84.8%。花芽的縱長變化規(guī)律同橫長類似，最快增長速率達100.4%?；ㄑ康臋M縱長從分化初期到分化結(jié)束分別增長了235.2%和248.1%，花芽縱長的增長率要高于花芽橫長的增長率。

表1 大花鐵線蓮花芽分化不同時期橫縱長度

2.3 雄配子發(fā)育過程

2.3.1 花藥壁發(fā)育

大花鐵線蓮的花藥具有4個小孢子囊，位于4個角隅處的細胞迅速分裂形成花藥雛體(圖2A-D)，細胞繼續(xù)分裂逐漸形成形似蝴蝶型的成熟花藥(圖2E)。最初形成的花藥雛體中存在分裂能力較強的細胞，其形態(tài)各不相同(圖2F)。隨著細胞分裂的進行，表皮里側(cè)的細胞分化出孢原細胞，經(jīng)平周分裂形成初生壁細胞和造孢細胞(圖2G、H)。造孢細胞不斷分裂分化(圖2J、K)，為花粉母細胞的形成奠定基礎(chǔ)。而初生壁細胞經(jīng)過分裂則形成2層次生壁細胞(圖2L、M)。這2層次生壁細胞從外至內(nèi)分化成藥室內(nèi)壁，中層和絨氈層多層細胞結(jié)構(gòu)，即花藥壁。隨著花藥發(fā)育的進行，細胞體積逐漸變大但藥室內(nèi)壁的儲藏物質(zhì)逐漸變少(圖2O-X)，后期稱為纖維層。中層細胞起初含有豐富的淀粉等物質(zhì)，具有兩層結(jié)構(gòu)(圖2O),到花粉母細胞減數(shù)分裂的時期，中層細胞被周圍擠壓，靠里的一層結(jié)構(gòu)被吸收掉(圖2P-S),另一層細胞也被擠壓而變得扁平但不消失，最終在成熟的花藥層細胞中類似于纖維層(圖2X)。隨著小孢子逐漸分化成為花粉，絨氈層在此過程中漸漸解體(圖2T-W)。最終，在花粉成熟階段，絨氈層僅留一點或完全解體(圖2X)。

A.營養(yǎng)生長期；B.花芽分化初期；C-E.萼片原基分化期；E-I.生殖生長錐；J.雄蕊原基分化期；K-P.雄蕊原基增多，外層雄蕊逐漸生成；Q-S.雌蕊原基分化期；T.腋生花芽；U.花藥結(jié)構(gòu)；V.雌蕊結(jié)構(gòu)；GC.營養(yǎng)生長錐；RC.生殖生長錐；CaP.花萼原基；Ca.花萼；SP.雄蕊原基；PP.雌蕊原基；St.花柱(顯微標尺：A-Q,T,U,V=100 μm；R-S=20 μm)。

A-E.花藥發(fā)育成型過程；F.花藥雛體；G-I.孢原細胞平周分裂；J-K.初生造孢細胞分裂；L.初生壁細胞分裂；M.初生壁細胞平周分裂形成兩層次生壁細胞；N.次生壁細胞分裂；O.花藥壁(小孢子母細胞時)；P-V.花藥壁(小孢子母細胞減數(shù)分裂時)；W.花藥壁(單核小孢子時)；X.花藥壁(成熟花粉時)；asc.孢原細胞；psc.初生造孢細胞；epi.表皮；end.藥室內(nèi)壁；ml.中層；tap.絨氈層(顯微標尺：A-E=50 μm，F(xiàn)-X=20 μm)。

2.3.2 小孢子產(chǎn)生

小孢子母細胞由最初的初生造孢細胞經(jīng)多次的有絲分裂而得到(圖3A)，之后不斷發(fā)育，歷經(jīng)2次減數(shù)分裂得到4個細胞核(圖3B-I)。而4個細胞核進行胞質(zhì)分裂形成四面體型或者左右對稱型的四分體(圖3J-O)，即為4個小孢子。最初分化得到的4個小孢子依舊處在胼胝質(zhì)壁內(nèi)，且互相隔離。后期在絨氈層解體時會分泌出胼胝質(zhì)酶，胼胝質(zhì)壁在酶的作用下而分解(圖3P-W)。自此，從中釋放出的4小孢子成為了獨立狀態(tài)，并形成4個單核的花粉粒(圖3X)。大花鐵線蓮的減數(shù)過程中，在減數(shù)第一次分裂完成之后有的能立即產(chǎn)生新的細胞壁，有的不立即產(chǎn)生新的細胞壁，上述兩種情況同時出現(xiàn)，因此認為，大花鐵線蓮胞質(zhì)分裂時，連續(xù)型和同時型2種分裂方式同時存在。

A.小孢子母細胞；B減數(shù)I前期細線期；C.減數(shù)I前期偶線期；D.減數(shù)I前期粗線期；E.減數(shù)I前期雙線期；F.減數(shù)I前期終變期；G.減數(shù)I中期；H.減數(shù)I后期；I.減數(shù)I末期；J.減數(shù)Ⅱ前期；K.減數(shù)Ⅱ中期；L、M.減數(shù)Ⅱ后期；N.四面體型四分體；O.左右對稱型四分體；P-U.胼胝質(zhì)溶解；V、W.釋放到藥室中的小孢子；X.單核小孢子(顯微標尺：A-X=20 μm)。

2.3.3 雄配子體發(fā)育

單核花粉粒隨著胼胝質(zhì)的溶解而逐漸呈分散的游離狀態(tài)(圖4A)。剛分散開的單核花粉粒細胞在顯微鏡下觀察可以看到，細胞沒有明顯的液泡，呈干癟皺縮狀，細胞壁較薄，細胞核此時處于細胞的中心位置，周圍有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器。隨后，單核花粉粒吸收大量的營養(yǎng)，體積也隨之變大，大液泡逐漸在視野中呈現(xiàn)出來，并且將細胞核擠到一旁，此時期稱之為單核靠邊期(圖4B)。單核小孢子繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)有絲分裂變成了二細胞花粉，在花粉粒中存在雙核，因有絲分裂過程中胞質(zhì)分裂不均等，2個子核大小不一，體積較大的為營養(yǎng)核，另外一個是小體積的生殖核(圖4C-F)。二細胞花粉粒逐漸成熟，在外形上呈近圓形且可見兩層花粉壁，而外壁上能夠觀察到萌發(fā)孔的痕跡(圖4G、H)。

A.單核花粉粒；B.單核靠邊期小孢子；C-E.營養(yǎng)細胞與生殖細胞的產(chǎn)生過程；F.初期形成的二細胞花粉粒；G、H.逐漸成熟的二細胞花粉(顯微標尺：A-H=20 μm)。

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，大花鐵線蓮花藥壁的發(fā)育過程和小孢子及雄配子的發(fā)育過程在發(fā)育時間上存在一定的對應(yīng)關(guān)系，當花藥壁完成最后的發(fā)育過程時，二細胞花粉也發(fā)育成熟(表2)。

表2 小孢子及雄配子發(fā)育階段對應(yīng)的花藥壁發(fā)育階段

2.4 雌配子發(fā)育過程

2.4.1 大孢子發(fā)生

在子房的胎座上著生著胚珠(圖5I)，胚珠原基(圖5A、B)就是由大花鐵線蓮子房腹縫線(圖5H)內(nèi)表皮下的一些細胞經(jīng)過不斷地平周分裂而產(chǎn)生的。原基尾端細胞經(jīng)發(fā)育而成了珠柄，與胎座連在一起，另一端形成突起，即為珠心。珠心尾部有一群細胞分裂旺盛，經(jīng)不斷分裂不斷延伸把珠心包圍起來而形成珠被。發(fā)育完善的胚珠為單室、單珠被和單個倒生的胚珠(圖5C-E)。但是也有一個胎座上存在兩個胚珠的情況，且兩個胚珠發(fā)育進程存在差異(圖5F、G)。隨著珠心和珠被的繼續(xù)發(fā)育，靠近珠孔一端的珠心表皮下細胞逐漸分化出了孢原細胞(圖5J)，經(jīng)平周分裂，形成二分體。接著分裂生成1個線型的大孢子四分體(圖5K-N)。四分體中，3個周緣細胞接近珠孔端，后期逐漸地退化消失完全，而遠離珠孔端的的造孢細胞繼續(xù)發(fā)育最終形成單核胚囊(圖5K-T)。

2.4.2 雌配子體發(fā)育

單核胚囊在發(fā)育過程中吸收很多營養(yǎng)物質(zhì)，所以體積逐漸增大，在整個珠心組織中占很大的空間位置(圖6A)。隨后發(fā)生一次有絲分裂形成2個子核，多數(shù)橫向排列，鮮有縱向排列(圖6B、C)。不久，2個子核向胚囊的兩極移動，生成二核胚囊(圖6D、E)，又發(fā)生一次有絲分裂形成了四核胚囊(圖6J)，但是有時兩端的子核分裂可能存在不同步現(xiàn)象或者其他狀況，胚囊內(nèi)可見3個核(圖6H、I)。四核胚囊的加倍分裂，最終胚囊擁有8個細胞核。8個細胞核的去向不一，其中，胚囊兩端的2個細胞核向中間靠攏，發(fā)育成含有2個極核的1個中央細胞。珠孔端的3個核最終分化成為1個較大的卵細胞和2個助細胞。合點端的3個核分化成3個反足細胞。最終，發(fā)育成為8核7細胞的成熟胚囊(圖6X)。

大花鐵線蓮的卵細胞多數(shù)位于珠孔端(圖6M、N)，鮮見位于合點端(圖6O)。已經(jīng)成熟的卵細胞中細胞器的數(shù)量會減少，珠孔端的大液泡散開成為小液泡，細胞核會更加貼近合點端(圖6K)。

2個助細胞緊緊相鄰，與卵細胞呈三角鼎力之勢(圖6L)。助細胞代謝旺盛，且豐富的細胞器使得細胞質(zhì)染色較深(圖6P)。助細胞在珠孔端的細胞壁向細胞腔內(nèi)分生成絲狀器(圖6Q)。

中央細胞的核是極核，有縱向和橫向兩種排列狀態(tài)(圖6R-S)，中央細胞表現(xiàn)為一定的極性，常向珠孔端靠近(圖6T-U)，有時也靠向反足細胞(圖6V)。

3個反足細胞在胚囊內(nèi)一般呈三角形排列(圖6W)。

3 結(jié)論與討論

通過對大花鐵線蓮胚胎學(xué)的初步研究，可以發(fā)現(xiàn),大花鐵線蓮花芽分化分為營養(yǎng)生長期、花芽分化初期、萼片原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，共5個階段。當植物的芽頂端形狀改變或體積變大時，認為這是花芽分化開始的跡象。大花鐵線蓮在花芽分化過程中，生長錐由尖銳逐漸平坦，這與袁德義[11]等的觀點十分相符。

大花鐵線蓮花藥4室，花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、1～2層中層和1層絨氈層構(gòu)成。絨氈層類型為腺質(zhì)絨氈層。這與毛茛科的側(cè)金盞[12]、金蓮花和驢蹄草的觀測結(jié)果相同[13]。一般認為，絨氈層細胞消失的過程就是為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)的過程[14]。大花鐵線蓮絨氈層是由內(nèi)層的次生壁細胞發(fā)育而成，當花粉母細胞將近完成減數(shù)分裂時，絨氈層細胞開始逐漸解體，最終，花粉成熟時絨氈層完全消失或僅存一點殘留。由此可以證明，絨氈層的狀態(tài)滿足小孢子發(fā)育過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。

大花鐵線蓮的小孢子母細胞孢質(zhì)分裂方式為連續(xù)型和同時型均存在，形成左右對稱型和四面體型的四分體，成熟花粉為2-細胞型。Heslop-Harrison[15]認為,胞間連絲的存在令同一藥室內(nèi)的小孢子母細胞同時進行減數(shù)分裂。而大花鐵線蓮最初的小孢子母細胞多呈不規(guī)則型且存在胞間連絲，在后期的減數(shù)分裂過程中沒有發(fā)現(xiàn)異常，較為同步，這與上述觀點吻合。

大花鐵線蓮子房為單室，單胚珠、單珠被、倒生胚珠。大孢子母細胞是由子房腹縫線內(nèi)表皮下的一些細胞分化得到的孢原細胞，經(jīng)平周分裂發(fā)育成造孢細胞，造孢細胞進一步分化而得到的。這和Tamura[16]所描述的毛茛科植物大孢子母細胞的由來十分接近。大孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂生成直線型四分體，胚囊為蓼型發(fā)育，含有7細胞8核。這些表現(xiàn)與已報道的鐵線蓮的胚胎學(xué)特征頗為相似[17-18]。

大花鐵線蓮的一朵花上會有多株雌蕊，各個雌蕊之間的發(fā)育存在著差異。此外，雌蕊和雄蕊的發(fā)育表現(xiàn)不同步，存在雌雄異熟的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育比雌蕊更早。這在核桃[19]、板栗[20]等植物中也出現(xiàn)過類似情況。植物的這種雌雄發(fā)育不同步的現(xiàn)象能有效延長授粉期[21]。

文中對東北地區(qū)大花鐵線蓮的花芽分化和花器官發(fā)育特性進行了較為詳細的研究，發(fā)現(xiàn)大花鐵線蓮在生長過程中，花的外部形態(tài)特征和內(nèi)部的配子體發(fā)育有相應(yīng)的對照關(guān)系。通過對外部形態(tài)特征的觀察，可以更好地掌握其內(nèi)部雌雄蕊的發(fā)育進程，以便預(yù)測花期、人工授粉加強管理等。本試驗使鐵線蓮屬植物的雌雄配子體發(fā)育和大小孢子相關(guān)的胚胎學(xué)研究更加豐富，也為大花鐵線蓮花粉、胚珠組織培養(yǎng)、遺傳育種及分子生物學(xué)提供可靠的理論依據(jù)。