動物源性食品中氯霉素殘留免疫分析技術(shù)研究進展

范素菊 李 嘉 楊興東

1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程學(xué)院，河南周口 466000；2.周口師范學(xué)院食品藥品檢驗檢測中心，河南周口 466001

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種抗菌類藥物，因其作用譜廣，價格低廉，廣泛應(yīng)用于我國的動物生產(chǎn)中，防止各種動物疾病的感染[1-2]。大量的研究表明，CAP 進入動物體內(nèi)并造成殘留，CAP 在人體的殘留會抑制人體造血機能、增強細菌耐藥性和引起機體的菌群失調(diào)等，甚至?xí)鹬旅摹盎覌刖C合征”[3]。因此，包括中國在內(nèi)的許多國家均明確規(guī)定在動物源性食品中禁止使用CAP，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定動物源性食品中CAP 的最高殘留限量為不得檢出。但在實際的動物生產(chǎn)中CAP 的濫用仍然存在，監(jiān)控動物源性食品中CAP 殘留是必不可少的[4]。目前，常用的檢測動物源性食品中CAP 殘留的方法主要包括色譜分析法（Chromatographic analysis）和免疫分析法（Immunoassay）。

1 色譜分析法

在氣相色譜（Gas chromatography，GC）[5]、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-mass spectrometry，GC-MS）色譜[6]分析時，由于CAP 不易揮發(fā)，在測定前需進行衍生化。因CAP有很強的紫外吸收，可直接采用液相色譜（High per?formance liquid chromatography，HPLC）及液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）進行測定[7-8]。色譜分析雖然具有很高的靈敏度，但是其具有測定程序繁瑣、專業(yè)性強和檢測費用高等缺點。Jian 等[9]開發(fā)并驗證了一種通過HPLC-MS 測定肉中CAP 的簡單、環(huán)保、可靠的方法。首先用乙二胺四乙酸-McIlvaine's 緩沖液萃取樣品，然后使用新型核-殼聚苯胺/聚丙烯腈納米纖維墊通過固相萃取進行純化，該法的檢測限為0.01μg/kg，可用于對豬肉、雞肉和牛肉中CAP 殘留的測定，結(jié)果與中國國家標(biāo)準方法相吻合，證明了該方法的可靠性和實用性。

2 免疫分析法

免疫分析法的核心是基于抗原（Antigen，Ag）、抗體（Antibody，Ab）特異性反應(yīng)[10]。其中，目前應(yīng)用最為廣泛的免疫分析方法是酶聯(lián)免疫法（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和側(cè)流免疫檢測法（Lateral flow immunoassay，LFIA）。近年來，基于核酸適配體建立的分析技術(shù)為快速檢測的進一步發(fā)展注入了新的活力。

2.1 抗CAP抗原的合成和抗體的制備

免疫分析方法的基礎(chǔ)是獲得優(yōu)質(zhì)、高效的抗體，而抗體又從抗原免疫動物所得。CAP 的相對分子質(zhì)量只有323.14，僅有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，需與載體蛋白結(jié)合才能成為完全抗原（免疫原）。楊艷艷等[11]利用琥珀酰酐改造CAP 為半抗原（Hap?ten）CAP 半琥珀酸酯(CAP-HS)，以混合酸酐法（Mixed anhydride method，MA）將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得免疫原CAP-HS-BSA，免疫BALB/c 小鼠后，采用細胞融合技術(shù)得到抗CAP 單克隆抗體（CAP mAb），效價和半數(shù)抑制濃度（Half maximal in?hibitory concentration，IC50）分別為1.28×105、7.54 ng/mL；張紅星等[12]采用重氮化法合成抗原，免疫大白兔后，所得抗體的效價和IC50分別為8.1×103、9.0 ng/mL；羅舜菁等[13]運用對氯甲基苯甲酸（CBA）、對氯甲基苯甲酸甲酯（MCB）分別對CAP 進行改造，再用MA 法將半抗原與載體蛋白合成為免疫原、檢測原，結(jié)果顯示，后者的靈敏度優(yōu)于前者；陸蕾等[14]運用重氮化法得到的抗體的效價為1.28×105，優(yōu)化建立的間接競爭ELISA（Indirect competitive ELISA,ic-ELI?SA）方法，其IC50為0.26μg/mL。楊偉群等[15]利用重氮法合成CAP免疫原（CAP-BSA），免疫家兔后獲得抗CAP 多克隆抗體（CAP polyclonal antibody, CAP pAb），經(jīng)ELISA 鑒定該抗血清具有良好的特異性，IC50值為13.65 ng/ml，檢測限（limit of detection，LOD）為1.01μg/L。李昊、李佳儀等[16-17]用重氮化法合成抗原，免疫小鼠后，所獲得抗體效價分別為2.187×105、1.28×105，前者抗體的競爭性為20.48%。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA 用酶標(biāo)記Ag 或Ab，適用于醫(yī)學(xué)實驗室、體外診斷產(chǎn)品制造商、監(jiān)管機構(gòu)、外部質(zhì)量評估和能力測試機構(gòu)，主要類型包括間接法、雙抗夾心法、競爭法，分別用于測定Ab、大分子Ag 和小分子Ag，競爭法特別適用于食品安全分析，該法又可分為直接競爭ELISA（Direct competition ELISA,dc-ELISA）和ic-ELISA。

1）直接競爭ELISA 法。張立辰等[18]以CAP mAb為基礎(chǔ)，建立了dc-ELISA，該方法IC50為0.54 ng/m L，LOD 為0.10 ng/mL，將該法用于測定鱈魚和蝦樣品中CAP的殘留，加標(biāo)回收率為62.6%～120.0%，CV范圍為0.94%～13.52%。劉姚等[19]以CAP mAb為基礎(chǔ)，建立了蜂蜜中CAPdc-ELISA 檢測法，對其6個影響因素進一步優(yōu)化，蜂蜜樣品的LOD 和定量限（Quan?tification Limit，LOQ）分別為0.15 ng/g 和0.33 ng/g，加標(biāo)回收率為97.58%～100.94%，批內(nèi)、批間CV 均小于11.0%。張連彥等[20]為了檢測動物源性食品中CAP 的非法添加，在優(yōu)化了反應(yīng)條件和前處理方法的基礎(chǔ)上，建立了dc-ELISA法，其LOD為1.0 mg/kg，添加回收率為81.0%～112.0%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）均小于10.0%。

2）間接競爭ELISA 法。ic-ELISA 的檢測原理主要是利用樣品中游離的待測物、ELISA 板的孔底部已包被待測物與已標(biāo)記的抗體發(fā)生競爭。胡擁明等[21]利用碳二亞胺法（EDC）和MA 法制備了CAP的完全抗原和檢測原，免疫新西蘭大耳白兔后得到pAb，以此抗體為基礎(chǔ)建立檢測CAP 殘留的ic-ELI?SA，改法的IC50值為7.275 ng/ml，與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率（Cross reaction rate,CR）均小于0.1%。齊寧利等[22]利用試劑盒檢測了魚、蝦水產(chǎn)品中CAP的殘留，該法的精密度為1.28%，LOD 為6.25 ng/kg，添加回收率為83.67%～87.06%。杜兵耀等[23]檢測了CAP ELISA 可視化微陣列芯片檢測試劑盒的特性，結(jié)果顯示該試劑盒在檢測范圍內(nèi)，其線性回歸具有良好的相關(guān)性，且與結(jié)構(gòu)類似物的CR 均小于1.0%，批間CV 小于20.0%，牛奶樣品中的平均回收率為108.5%，LOD為0.067μg/L。Doan[24]從Afyonkarahisar的14 個不同銷售點收集了總共82 尾魚樣本，使用ELISA 方法分析樣品中的CAP。結(jié)果顯示，高達18.3%的樣品被CAP 污染，在陽性魚肉樣品中，CAP殘留濃度范圍為0.54～10.6 ng/kg，陽性樣品中的CAP 殘留平均含量為4.25±2.78 ng/kg。CAP 是禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗生素，但魚肉樣品中可檢測到的CAP殘留表明該抗生素的非法使用。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Chemiluminescence im?munoassay，CLIA）的靈敏度和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA，也可用于大規(guī)模樣品的篩選。薩仁托雅等[25]用CLEIA 法檢測水產(chǎn)品中CAP 的殘留，其LOD為0.016 ng/g，線性范圍為0.025～6.400 ng/g，批內(nèi)CV在5.5%～11.3%之間，批間CV 在12.3%～20.9%之間。任帥等[26]將免疫原CAP-HS-BSA 免疫新西蘭大白兔，得到CAP pAb，以此為基礎(chǔ)建立了檢測實際牛奶樣品中CAP 殘留的基于iPDMS 膜的化學(xué)發(fā)光芯片免疫檢測法，該法的IC50為263.0 ng/mL，線性范圍為1～5000 ng/mL，LOD 為1 ng/mL，牛奶中CAP的添加回收率為77.0%～100.5%，RSD＜15%。

2.4 側(cè)流免疫檢測法

側(cè)流免疫檢測法是在mAb、免疫層析技術(shù)和標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的快速檢測方法。大多數(shù)以膠體金、熒光素或熒光微球標(biāo)記Ab，基于Ag、Ab的特異性結(jié)合。該法將膠體金標(biāo)記的Ab交聯(lián)到試紙條的結(jié)合墊，在試紙條硝酸纖維素膜（NC）上噴涂有顯示結(jié)果的測試線（test line, T line）及控制線（control line,C line），樣品中抗原與抗體結(jié)合后，膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，通過與控制線顏色的對比實現(xiàn)快速檢測。

Bai等[27]首次制備了一種新的熒光免疫色譜條，用于檢測雞肌肉中的CAP 殘留。應(yīng)用CAP-BSA 結(jié)合物，抗CAP 的PAb、mAb 構(gòu)成熒光免疫層析條。通過電荷耦合裝置掃描儀檢測熒光強度，并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字值。CAP 線性工作范圍為0.1～20 ng/mL，在10 min 內(nèi)LOD 為0.1 ng/mL。將該試劑盒的性能與市售ELISA試劑盒進行了比較，相關(guān)系數(shù)為0.99，表明該新型試劑盒具有良好的CAP 定量能力。Zhou 等[28]開發(fā)了一種膠體金免疫色譜分析法（GI?CA），用于快速檢測水產(chǎn)品中的CAP殘留。NC膜被用作載體，CAP pAb 被用作標(biāo)記蛋白，制備的膠體金納米顆粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）的平均直徑約為20 nm，膠體金溶液的最佳pH 值和CAP 抗體的量分別為8.0 和7.2μg/mL，純化后將CAP 抗體固定在結(jié)合墊上，將CAP 偶聯(lián)物和山羊抗兔IgG 包被在NC 膜上，用1% BSA 封閉非特異性位點，標(biāo)準溶液中CAP的最低可檢測濃度為0.5 ng/mL，具有良好的重現(xiàn)性。對于在背肌中注射單劑量CAP 的鯽魚的真實樣品，CAP 殘留物的最低可檢測濃度為0.5μg/kg，色譜分析時間少于10 min，并且該條在不同溫度下具有90 d 以上的長存儲壽命，該試紙條提供了一種快速檢測水產(chǎn)品中CAP 殘留的方法。

丁喬棋等[29]利用羧基化CdTe/ZnSe 量子點熒光微球標(biāo)記CAP mAb 獲得熒光探針，將CAP 免疫原（CAP-HS-BSA）、羊抗鼠二抗（Goat anti-mouse HRP-labeled immunoglobulin，GaMIg-HRP）分別噴涂NC 膜上，并保持一定距離，形成T 線、C 線，完成CAP 試紙條的裝配。用該試紙條測定牛奶樣品中CAP 的殘留，用時不超過15 min，線性范圍在0.1～100.0 ng/mL 之間，LOD 值為0.1μg/L。牛奶樣品CAP 的添加回收率在93.3%～97.9%之間，相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation,RSD）為4.9%～6.9%。劉廣源等[30]制備了牛奶中抗菌素的快速檢測試紙，并對其各個反應(yīng)條件進一步優(yōu)化，利用該試紙檢測了市售散裝及袋裝牛奶中CAP 的殘留，其測定結(jié)果與國標(biāo)法基本相同。崔乃元等[31]用羧基化銪微球標(biāo)記CAP mAb，CAP 抗原及GaMIg-HRP 分別包被于NC膜上作為T線和C線；用所建立的時間分辨熒光免疫層析法檢測水產(chǎn)品（魚、蝦、蟹）中CAP的殘留，LOQ 為0.1μg/kg，添加回收率為73.5%～114.2%，CV 為3.9%～11.5%，滿足了水產(chǎn)品中CAP殘留測定的要求。湯軼偉等[32]將GSH-Mn-ZnS QD與CAP mAb 偶聯(lián)制備熒光探針并對其各個組件的包被量進行了優(yōu)化，制備出CAP 熒光免疫層析試紙條，優(yōu)化后該試紙條的LOD 可達100 ng/mL，該試紙條靈敏度高、特異性好、可應(yīng)用于鰻魚樣品中CAP的殘留測定。

3 核酸適配體技術(shù)

免疫分析檢測法雖然具有操作簡便、檢測時間短、成本低等優(yōu)點，但其所用的核心材料為Ab，Ab易受溫度、時間、pH 等外界環(huán)境的制約而出現(xiàn)變性[33]。鑒于此，探尋新的動物源性食品中CAP 高效檢測方法勢在必行。核酸適配體（Aptamer，Apt）又被稱為“化學(xué)抗體”，是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)（System antievolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從隨機序列文庫中分離得到的一段DNA 或RNA序列，Apt能識別對應(yīng)的靶標(biāo)并與之特異性結(jié)合，與常用的Ab 相比具有性質(zhì)穩(wěn)定，特異性、靈敏性均強等優(yōu)點，成為分子生物學(xué)、分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注熱點之一。

吳彩葉等[34]將Fe3O4磁珠標(biāo)記CAP 適配體（CAP Apt）獲得捕獲探針，用MOF（Fe-MOF）標(biāo)記該Apt的互補鏈到作為納米示蹤劑（MOF-cDNA），將兩者偶聯(lián)后可得到鐵磁性仿生復(fù)合探針，完成了仿生比色傳感器的構(gòu)建，改法的檢測范圍為0.01～10 ng/mL，LOD 為0.3 pg/mL（S/N=3），實際樣品的加標(biāo)回收率為86.9%～93.5%。高慧菊等[35]構(gòu)建了基于Apt-聚合酶螯合物-氧化鈀納米顆粒（Apt-En Vision-PdO, cD?NA-EV-PdO）復(fù)合物進行雙重信號放大的比色Apt傳感器方法來測定CAP的殘留，該方法檢測范圍為0.02～150 ng/mL，LOD 為0.01 ng/m L，用該方法檢測了魚肉和鵝肉中的CAP 的殘留，其結(jié)果與ELISA 法相同。Duan 等[36]基于CAP 特異性適體和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）設(shè)計了一種新穎的CAP 檢測靈敏方法：首先將CAP Apt 與生物素修飾的互補探針雜交，然后通過生物素固定在鏈霉抗生物素蛋白綴合的磁珠上。當(dāng)添加CAP 時，Apt 將通過形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而與CAP 特異性結(jié)合，并從磁珠中釋放出來以通過qRT-PCR 進行CAP 檢測。優(yōu)化了影響該基于適體的檢測系統(tǒng)的測定精度的因素（即探針鏈長度，適體濃度，NaCl濃度和孵育時間）。在最佳條件下，該檢測系統(tǒng)對CAP 表現(xiàn)出高靈敏度，LOD 為0.1ng/ mL（線性范圍為0.1～20 ng/mL）。該檢測系統(tǒng)用于檢測實際加標(biāo)牛奶中的CAP，加標(biāo)牛奶樣品中CAP的回收率為94.0%～102.0%。

4 結(jié)語

動物源性食品中CAP 殘留帶來的食品安全問題引起了公眾的廣泛關(guān)注，氯霉素的檢測技術(shù)在不斷的發(fā)展。目前，色譜分析可以作為確證檢測，相對成熟的免疫分析技術(shù)，如ELISA、膠體金試紙條等可以用于大規(guī)模檢測樣品的篩選，綜合利用上述兩類檢測方法是當(dāng)前切實可行的措施。針對這兩類方法的缺陷，開發(fā)出新型的檢測方法勢在必行，如基于核酸適配體建立的免疫分析技術(shù)、生物傳感器等，以便更好地為食品安全保駕護航。