中國(guó)漢族人群APOB rs10199768和rs1367117基因多態(tài)性與HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者PEG-IFN-α療效的相關(guān)性

郭健慧， 曾勇彬， 歐啟水

截至2016年，全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者達(dá)2.91億人[1]。中國(guó)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者達(dá)2 000萬，60%的肝硬化和80%的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)均由HBV感染引起[2]。干擾素α(interferon α, IFN-α)是治療CHB的一線藥物，在獲得HBV表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)清除方面優(yōu)于核苷類似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]，且復(fù)發(fā)率較低[3]。但只有少部分人能夠獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，對(duì)IFN-α治療具有個(gè)體差異的原因仍知之甚少。

載脂蛋白與肝炎病毒感染和IFN-α療效關(guān)系密切。載脂蛋白能夠中和抗體、促進(jìn)丙型肝炎病毒(hepatitis C, HCV)進(jìn)入肝細(xì)胞，幫助HCV逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別[4]。血脂水平與IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療HCV的療效有關(guān)[5]。慢性HBV感染可導(dǎo)致血脂代謝異常，相反地，應(yīng)用嗜肝脂蛋白抑制劑能夠抑制肝細(xì)胞的HBV感染[6-8]。但載脂蛋白B(apolipoprotein B, APOB)與HBV感染關(guān)系的研究仍不多見，APOB與IFN-α療效的關(guān)系尚不清楚，APOB的基因多態(tài)性在HBV治療結(jié)局中是否扮演一定的角色還未被探索。本研究旨在探討APOBrs10199768和rs1367117基因多態(tài)性在HBeAg陽性CHB患者IFN-α療效中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2017年2月-2020年12月肝病中心收治的接受聚乙二醇干擾素(pegylated interferon α, PEG-IFN-α)治療滿48周的HBeAg陽性的CHB患者124例，男性86例，女性38例，年齡(27.59±4.97)歲(20～44歲)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥16歲；(2)HBsAg陽性≥6個(gè)月，HBeAg陽性；(3)基線HBV DNA≥2 000 IU/mL；(4)血清基線丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)≥2倍正常值上限；(5)既往未接受過任何抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)HCV、HIV、HDV重疊感染者；(2)接受免疫抑制劑、激素治療、肝移植患者；(3)非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、肝硬化、HCC等其他肝臟疾病患者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

124例中，PEG-IFN-α單藥治療59例，PEG-IFN-α和NAs聯(lián)合治療65例。根據(jù)PEG-IFN-α治療結(jié)束后24周(第72周)的療效，將患者分為兩組：完全應(yīng)答(complete response, CR)組38例和應(yīng)答不佳(suboptimal response, SR)組86例。根據(jù)歐洲肝病學(xué)會(huì)指南(EASL 2017)定義，CR組須同時(shí)滿足HBV DNA<500 IU/mL、HBeAg<1 S/CO和ALT<40 U/L；未同時(shí)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)為SR組。

1.2 方法

1.2.1 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)檢測(cè) 收集EDTA抗凝全血2 mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國(guó)QIAGEN公司)提取外周血全血DNA。采用Asian Screening Array(ASA，美國(guó)Illumina公司)芯片技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，由博淼生物科技(北京)有限公司完成。SNP位點(diǎn)滿足MAF>0.01、哈迪溫伯格(Hardy-Weinberg, HWE)遺傳平衡定律檢驗(yàn)P值>0.05。

1.2.2 臨床指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)PEG-IFN-α治療的CHB患者在基線(0周)和12、24、36、48、60、72周的血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT水平以及基線血清APOB蛋白水平。血清HBsAg和HBeAg使用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析儀(Architect-i4000，美國(guó)雅培公司)檢測(cè)；APOB、ALT和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)使用全自動(dòng)生化分析儀(ADVIA 2400，德國(guó)西門子公司)檢測(cè)；HBV DNA使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Lightcycler480，瑞士羅氏公司)和HBV核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光探針法，中國(guó)湖南圣湘生物科技有限公司)測(cè)定。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monocular cell, PBMC)培養(yǎng) 隨機(jī)納入未經(jīng)任何抗病毒治療的HBV感染者99例，其中rs10199768 CC型92例、AC型6例、AA型1例；rs1367117 GG型75例、AG型22例、AA型2例。取1 mL EDTA抗凝全血經(jīng)Ficoll分離液分離出PBMC后，用96孔板在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。加入IFN-α(1 000 U/mL)作用6 h，收集細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取和檢測(cè)。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) mRNA引物在GenBank上進(jìn)行設(shè)計(jì)，并經(jīng)BLAST序列比對(duì)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性及特異性。SNP位點(diǎn)所在序列的引物通過GenBank上選取位點(diǎn)前后各5 000 bp(共10 000 bp)的FASTA序列，復(fù)制到Oligo 7軟件上進(jìn)行設(shè)計(jì)，選取位點(diǎn)處于擴(kuò)增產(chǎn)物(350～550 bp)內(nèi)并距兩端20 bp以上的引物序列。引物由上海華大基因有限公司合成(表1)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIZol試劑(Thermo Fisher，美國(guó)Invitrogen公司)于-20 ℃保存RNA，RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用TB Green Premix Ex Taq(日本TaKaRa Bio株式會(huì)社)，qRT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；解鏈95 ℃ 5 s→退火60 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 患者的性別、年齡、基線HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST水平在CR組和SR組間的分布差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PEG-IFN-α單藥治療和PEG-IFN-α聯(lián)合NAs治療在CR組和SR組間的分布差別也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.2APOB基因多態(tài)性與CHB患者PEG-IFN-α的療效相關(guān)APOBrs10199768和rs1367117的基因型在CR組和SR組間的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036和P=0.021)。兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性經(jīng)Pearsonχ2檢驗(yàn)，均符合HWE遺傳平衡定律：rs10199768 C>A，CR組P=0.597，SR組P=0.825；rs1367117 G>A，CR組P=0.130，SR組P=0.947。SR組中的rs10199768 CC基因型和C等位基因頻率顯著高于CR組(P=0.036和P=0.040)，rs1367117 GG基因型和G等位基因頻率顯著高于CR組(P=0.021和P=0.017，表3)。

2.3 APOB在SR組中的表達(dá)較CR組高 SR組的基線血清APOB水平較CR組高(P=0.007)，但APOB水平在rs10199768 GG/AG基因型和rs1367117 CC/AC基因型中的分布差別則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

2.4 rs10199768、rs1367117與PEG-IFN-α治療過程臨床指標(biāo)的關(guān)系 PEG-IFN-α治療0、12、24、36、48、60、72周，HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT水平在APOBrs1367117 GG型和AG型中的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PEG-IFN-α治療12和24周時(shí)，APOBrs10199768 AC型患者的HBeAg濃度較CC型低(P=0.017和P=0.018)(圖2)。

2.5 rs10199768影響IFN-α體外誘導(dǎo)的抗病毒蛋白的表達(dá) IFN-α體外刺激PBMC后，ADAR、MxA、OAS1、PKR、ISG20、ISG15、JAK1、STAT1、STAT2、USP18、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PTPN6、IFIT3和STING的mRNA水平在rs1367117不同基因型間的表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rs10199768 AA+AC型感染者的STAT1和ISG15的mRNA表達(dá)水平較CC型高(P=0.005和P=0.018)，其他基因的表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

3 討 論

HBV感染可引起慢性肝炎、肝硬化和HCC，積極治療CHB仍是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。IFN-α治療CHB的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為30.75%～36.3%，其療效存在個(gè)體化差異[3]。研究表明，宿主基因的SNP可能是IFN-α治療個(gè)體化差異的因素之一[9-11]。

APOB是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)等的主要成分，主要參與甘油三酯(triglyceride, TG)和膽固醇酯(cholesteryl ester, CHE)的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。血清APOB水平與肝臟疾病進(jìn)展有關(guān)。APOB與HCV感染關(guān)系密切。APOB為HCV進(jìn)入肝細(xì)胞并產(chǎn)生具有完全傳染性的HCV所必需，抑制APOB的表達(dá)可減少HCV感染[13]。APOBN4311S (g.41553a > g) rs1042034的AA基因型與HCV陽性顯著相關(guān)，可能通過促進(jìn)HCV經(jīng)LDL受體進(jìn)入肝細(xì)胞而影響HCV感染[14]。APOB-516C/T啟動(dòng)子的基因多態(tài)性可能是女性HCV感染的保護(hù)因素[15]。在HBV感染時(shí)，HBV可通過抑制微粒體TG轉(zhuǎn)移蛋白阻斷APOB的表達(dá)，HBx蛋白還能抑制APOB的分泌和加速膽汁酸的合成[16-18]。但APOB與HBV感染結(jié)局關(guān)系的相關(guān)研究仍然較少，研究顯示，血清APOB水平與PEG-IFN-α治療CHB的療效相關(guān)[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，APOB水平與PEG-IFN-α治療CHB應(yīng)答不佳有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

rs10199768位于APOB基因的內(nèi)含子，內(nèi)含子在基因編輯和遺傳調(diào)控中的作用仍有待研究。rs1367117位于APOB基因的第4外顯子，A等位基因的出現(xiàn)使編碼的氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變，由蘇氨酸變成異亮氨酸。研究顯示，rs1367117對(duì)脂質(zhì)性狀具有極顯著的加性遺傳效應(yīng)，對(duì)肥胖性狀具有極顯著的母系特異性效應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs10199768和rs1367117與CHB患者PEG-IFN-α的療效相關(guān)，rs10199768 A等位基因與PEG-IFN-α治療CHB患者的應(yīng)答有關(guān)，rs1367117 G等位基因與PEG-IFN-α治療CHB患者的應(yīng)答不佳有關(guān)。rs10199768 A等位基因與PEG-IFN-α治療早期HBeAg水平的下降有關(guān)；在探索rs10199768 A等位基因如何參與IFN-α抗病毒作用的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，IFN-α體外刺激含有A等位基因的HBV感染者的PBMC后，STAT1和ISG15基因的mRNA表達(dá)增高，提示A等位基因可能有助于IFN-α誘導(dǎo)的抗病毒蛋白的表達(dá)，從而提升IFN-α的效應(yīng)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)rs1367117 A等位基因參與了IFN-α的效應(yīng)作用。

不同于其他PEG-IFN-α單藥治療的研究，本研究同時(shí)納入了PEG-IFN-α與NAs聯(lián)合治療的樣本。PEG-IFN-α被認(rèn)為能夠提高患者的免疫應(yīng)答能力而發(fā)揮抗病毒作用，而NAs作為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，能夠抑制HBV DNA的復(fù)制，二者的抗病毒機(jī)制并不相同。NAs持續(xù)抑制HBV DNA，PEG-IFN-α的HBeAg清除率高[21]，因此臨床上二者聯(lián)合或序貫用藥非常普遍。但NAs聯(lián)合用藥并不影響在PEG-IFN-α療程終點(diǎn)的療效判斷，本研究中兩種用藥方式在不同應(yīng)答組中的分布差別并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究納入的樣本能夠反映治療人群的整體構(gòu)成，具有代表性。

APOB基因多態(tài)性與CHB患者IFN-α療效關(guān)系的研究仍較罕見，本研究為遺傳因素在IFN-α抗病毒治療中的作用提供了依據(jù)，APOB基因多態(tài)性檢測(cè)可能有助于在抗病毒治療前預(yù)測(cè)對(duì)IFN-α應(yīng)答較好的患者，對(duì)CHB患者的精準(zhǔn)治療起關(guān)鍵作用。APOB基因多態(tài)性如何參與IFN-α抗病毒作用，將來是否成為IFN-α治療前的生物標(biāo)志物，仍需通過更大的樣本量和更深入的機(jī)制進(jìn)行研究。