僵蠶水溶性物質(zhì)指紋圖譜及共有峰識別研究

王斯琦, 張露蓉, 陳 偉, 潘韻芝,周 峰, 蘇子衡, 程軍平

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院, 江蘇 蘇州, 215000;2. 江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院, 江蘇 蘇州, 215000)

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyxmorilinnaeus4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體[1]。僵蠶藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]中就對僵蠶的功能有了簡單介紹: 僵蠶主要治療驚厥及男子陰瘍病?！侗静菥V目》[3]又全面總結(jié)了僵蠶的藥效與主治: 治風(fēng)化痰，散結(jié)行經(jīng)，指甲軟薄，治諸血病，散風(fēng)疾結(jié)，小兒瘧蝕，月中風(fēng)痔?，F(xiàn)代文獻[4-8]記載僵蠶具有祛風(fēng)止痛、化痰解散、息風(fēng)止癢等功效。近年來，僵蠶的市場需求量不斷提高，但僵蠶品質(zhì)良莠不齊，直接導(dǎo)致市售僵蠶的化學(xué)成分以及含量存在較大差異，影響了后期僵蠶入藥的安全性[9]。此外，市場上對僵蠶質(zhì)量控制還缺少全面、系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)，難以對藥材進行準(zhǔn)確的差異甄別[10]。

水煎法是傳統(tǒng)的中藥處理方法，臨床中對水煎劑的藥理作用已有研究，中藥水溶性成分的研究不僅是對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，也是確定中藥水煎劑藥理作用的根本[11]?，F(xiàn)有文獻[12-14]已經(jīng)建立了僵蠶的指紋圖譜方法，但對僵蠶供試品溶液的處理主要采用不同濃度的甲醇或乙醇作為溶劑，對僵蠶中的醇溶性物質(zhì)進行分析，而僵蠶的水溶劑超聲提取方法[15]也僅說明了僵蠶在不同溶劑中化學(xué)組分存在差異，并未對其化學(xué)成分進行全面鑒定。僵蠶水溶性特征化學(xué)成分的識別對于增強其質(zhì)量控制的專屬性及準(zhǔn)確性具有重要的意義。本研究在此基礎(chǔ)上采用加熱回流提取方式對僵蠶進行處理，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)建立僵蠶水溶性物質(zhì)的指紋圖譜，在19個共有峰中質(zhì)譜解析出10種化學(xué)成分。本研究將LC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于僵蠶的指紋圖譜分析中，此分析方法具有科學(xué)性、系統(tǒng)性和全面性等優(yōu)點，可為僵蠶的質(zhì)量控制研究提供參考價值，同時也可為進一步研究僵蠶水溶性成分藥理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters 公司); AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀(美國AB公司); Heizbad HBdigit玻璃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司); 超聲波清洗機(250 W, 40 kHz, 南京先歐儀器制造有限公司); 高速離心機(德國Sigma公司); PL203電子天平(Mettler-Toledo公司); 隔膜真空泵(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑及樣品

試劑: 水(超純水); 乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司); 磷酸(分析純，上海聯(lián)試化工試劑有限公司)。10個批次藥材樣品均購自蘇州春暉九鼎藥鋪有限公司，批號見表1。

表1 樣品來源信息

1.3 方法

1.3.1 色譜條件: 色譜柱為Acclaim PA 25 μm C18(4.6 mm×250.0 mm); 流動相 A為0.2%的磷酸水溶液; 流動相 B為乙腈; 流速為0.2 mL/min; 柱溫為30 ℃; 檢測波長為265 nm; 進樣量為10 μL。洗脫梯度見表2。

表2 流動相梯度洗脫梯度表

1.3.2 質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源(ESI); 正負(fù)離子模式檢測; 質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)為50～2 000; 噴霧電壓為5 500 V; 解簇電壓為100 V; 碰撞電壓為40 eV; 碰撞電壓差為20 eV; 離子源溫度為600 ℃; 霧化器為60 psi; 輔助加熱器為60 psi; 氣簾氣為40 psi。

1.3.3 供試品溶液的制備: 取批號20200129的僵蠶藥材供試品適量，粉碎過100目篩，取僵蠶藥材粉末約5 g, 精密稱定，分別加10倍量的水、8倍量的水加熱回流2次, 30 min/次，合并濾液，在30 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮到25 mL, 提取液在12 000 轉(zhuǎn)/min的高速離心機下離心10 min, 取上清液，即獲得供試品溶液。

2 結(jié) 果

2.1 僵蠶液相指紋圖譜的建立

2.1.1 精密度考察: 將制得批號為20200129的供試品1份重復(fù)進樣6次，結(jié)果顯示，共有峰相對保留時間的RSD值為0.21%～0.85%, 均小于1.00%; 峰面積的RSD值為0.46%～4.66%, 均小于5.00%, 符合要求。

2.1.2 重復(fù)性考察: 取批號為20200129的樣品6份，平行制備供試品溶液，進高效液相色譜(HPLC)儀。結(jié)果顯示，共有峰相對保留時間的RSD值為0.15%～0.75%, 均小于1.00%; 峰面積的RSD值為0.85%～4.57%, 均小于5.00%, 符合要求。

2.1.3 穩(wěn)定性考察: 取制得批號為20200129的供試品1份，于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD值為0.14%～0.87%, 均小于1.00 %; 相對峰面積RSD值為1.10%～4.71%, 均小于4.71%, 符合要求。

2.2 僵蠶藥材指紋圖譜的建立及相關(guān)分析

2.2.1 指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn): 按照上述確定的色譜-質(zhì)譜條件，測定10個批次不同產(chǎn)地僵蠶的色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的指紋圖譜。色譜中各物質(zhì)的分離度良好，含量較高，所以選其作為僵蠶藥材質(zhì)量和活性物質(zhì)的指標(biāo)。依據(jù)國家藥典委編寫的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版》，采用S1作為參照圖譜，選擇時間寬度為0.1, 生成色譜峰方法為中位數(shù)，生成對照圖為R, 選用多點校正方式對其共有峰進行校正，并確定了19個共有峰。HPLC指紋圖譜的生成: 選擇編號從S1～S10共10個批次僵蠶藥材的色譜圖生成的HPLC重疊圖譜見圖1，軟件生成的對照HPLC-質(zhì)譜指紋圖譜見圖2。

2.2.2 指紋圖譜相似度評價: 將10個批次僵蠶藥材的指紋圖譜導(dǎo)入軟件，計算10個批僵蠶藥材指紋圖譜的相似度值，其相似度值為0.985～1.000, 見表3。

表3 10批僵蠶樣品HPLC指紋圖譜的相似度

2.2.3 僵蠶藥材中共有峰識別及成分鑒定: 采用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，按上述條件對樣本進行分析，得到了僵蠶水提物共有峰的液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)，見表4。僵蠶藥材中主峰化合物的分子結(jié)構(gòu)圖見圖3。僵蠶的液相色譜圖正離子和負(fù)離子模式下的質(zhì)譜總離子流圖見圖4。

表4 僵蠶水提物共有峰的HPLC-MS/MS分析

3 討 論

本實驗通過DVD檢測器對僵蠶供試品溶液進行檢測，考慮色譜峰的分離度及基線的穩(wěn)定性等情況，發(fā)現(xiàn)265 nm為最佳檢測波長。同時，本實驗對色譜條件進行優(yōu)化，考察了不同溫度(25、30 ℃)及不同流速(0.2、0.5 mL/min)條件下對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)30 ℃下的色譜峰信號響應(yīng)值高、峰面積大，且分離度更好；液質(zhì)的流速一般不宜過大，流速大容易導(dǎo)致溶劑效應(yīng)，因此流速選擇0.2 mL/min。本實驗又對甲醇、乙腈作為有機相以及醋酸、不同濃度磷酸水(0.1%、0.15%、0.2%)作為流動相進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2%的磷酸水溶液-乙腈下色譜峰分離度最好且基線平穩(wěn)。因此最終確定本實驗的條件為0.2%的磷酸水溶液-乙腈, 265 nm的波長, 30 ℃的柱溫, 0.2 mL/min的流速。

國內(nèi)外研究[18-19]發(fā)現(xiàn)僵蠶中含有多種化學(xué)成分，包括蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等，具有很高的藥用價值，有抗凝、抗血栓、抗癌、鎮(zhèn)定催眠和降糖降脂等作用。但是僵蠶生品不宜入藥，因生藥材具有較強的腥臭味，藥效較強，容易造成惡心、干嘔，不僅會刺激橫軸的胃腸道，還增高了過敏的風(fēng)險。因此，一般僵蠶炮制后入藥。研究[20]報道，僵蠶的炮制方法一般為麩炒等。湯劑作為中國使用最早的劑型，其在辨證施治及隨癥加減時具有較強的適應(yīng)性，制備工藝簡單，藥效發(fā)揮迅速，應(yīng)用廣泛。中藥通過在水中加熱沸騰以后再轉(zhuǎn)小火進行煎熬，可用于調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)，祛除疾病，且副作用小[21-23]。因此，除麩炒外，僵蠶的炮制方法還可采用傳統(tǒng)的水煎法，但尚無文獻對僵蠶水溶性物質(zhì)進行研究。

本實驗在傳統(tǒng)的制備工藝基礎(chǔ)上對僵蠶中水溶性成分進行分析，為進一步探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。本實驗建立了LC-MS/MS色譜技術(shù)，對僵蠶中水溶性成分進行快速分析。近年來, LC-MS/MS等技術(shù)被應(yīng)用于化學(xué)成分的分析與鑒定，該技術(shù)結(jié)合了色譜的強分離性以及質(zhì)譜的強定性優(yōu)勢，廣泛地應(yīng)用于缺對照品的情況下對色譜峰鑒定[24-25]。本實驗將僵蠶水浴回流提取樣品經(jīng)過液相色譜分離后電噴霧質(zhì)譜方法檢測，通過分子離子峰確定共有峰可能的相對分子質(zhì)量，推測出僵蠶藥材中10種化學(xué)成分的歸屬及結(jié)構(gòu)。僵蠶水溶性成分中核苷類成分最為豐富，確認(rèn)出腺嘌呤、尿嘧啶、β-胸苷、尿苷和腺苷。除此之外，本實驗還鑒定出少量肌酐、黃酮類的槲皮素以及甾體類的β-谷甾醇。雖然僵蠶水溶性成分中核苷類成分較多，但其中識別出含量最高的成分為草酸銨，該成分可用于僵蠶藥材的定性鑒別?？傊緦嶒灲⒘私┬Q水溶性的LC-MS/MS指紋圖譜，該方法穩(wěn)定性好、信息量豐富，在對僵蠶進行質(zhì)量控制方面具有重要意義。