脂肪干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的研究進(jìn)展*

賴文濤，張曉璐，趙志軍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心)

顱骨缺損是創(chuàng)傷、腫瘤、手術(shù)等引起的常見(jiàn)臨床問(wèn)題。顱骨缺損導(dǎo)致顱內(nèi)壓變化等臨床癥狀，因此修復(fù)顱骨缺損十分必要。目前臨床治療顱骨缺損的主要方法為自體骨、異體骨、鈦網(wǎng)等材料修補(bǔ)。如果缺損范圍較大，涉及自體骨采集過(guò)多，則會(huì)導(dǎo)致供體部位功能障礙；異體骨以及鈦網(wǎng)等材料存在免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，目前缺乏一種較好的方法來(lái)治療大面積顱骨缺損。顱骨缺損直徑<3 cm可以自愈，不需要進(jìn)行顱骨修復(fù)手術(shù)，一般>3 cm的缺損要進(jìn)行顱骨修復(fù)手術(shù)。基于干細(xì)胞的骨再生和骨組織工程技術(shù)是顱骨修復(fù)和重建領(lǐng)域的一種尖端技術(shù)。脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，Adscs)是一類具有成骨分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有取材容易、少量組織即可獲取大量標(biāo)本，同時(shí)具有體外穩(wěn)定增殖，適合自體移植等特點(diǎn)，因此在顱骨缺損修復(fù)中得到廣泛研究[1]。但由于缺少相應(yīng)的血液系統(tǒng)供應(yīng)，導(dǎo)致工程骨植入后骨形成不良[2]，這對(duì)大面積顱骨缺損的臨床重建提出巨大挑戰(zhàn)，因此血管生成對(duì)組織工程骨的構(gòu)建具有重要意義。

1 脂肪干細(xì)胞的特點(diǎn)及表面標(biāo)志

1.1脂肪干細(xì)胞的特點(diǎn) 2001年Zuk等[3]首次成功分離和培養(yǎng)出Adscs，其特性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchyml stem cell，Bmscs)相似。Adscs具有很強(qiáng)的增殖以及多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。Adscs還具有抗缺氧能力強(qiáng)、來(lái)源豐富、易于分離、免疫原性低等特點(diǎn)[2]。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，可以反復(fù)獲取，并且具有血管分化的潛能[2]。從脂肪組織中獲取干細(xì)胞的數(shù)量至少是同等骨髓中可獲取數(shù)量的500倍[4]。據(jù)報(bào)道，Adscs的衰老時(shí)間比Bmscs晚，其增殖能力也更強(qiáng)[5]。相比于其他類型的干細(xì)胞，Adscs在某些生長(zhǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子的自分泌中也更為活躍[6]，例如Adscs表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D(VEGF-D)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)mRNA水平高于其他間充質(zhì)干細(xì)胞群體，包括Bmscs、真皮乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞。在缺氧條件下，Adscs分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的數(shù)量大約是正常氧條件下的5倍[7]。因此Adscs在缺氧條件下能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，減少細(xì)胞凋亡。

1.2Adscs的表面標(biāo)志 Adscs與其他干細(xì)胞一樣，存在多個(gè)表面標(biāo)志。關(guān)于CD34在Adscs中的表達(dá)，現(xiàn)有文獻(xiàn)存在很大差異，人們普遍認(rèn)為CD34不存在于細(xì)胞表面[8]，然而這一觀察主要是基于體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，而不是組織原有的MSCs。也有研究表明，CD34表達(dá)于新分離的Adscs中，并在幾次細(xì)胞傳代后消失[9]。與其他類型的MSCs相似，由于缺乏明確的細(xì)胞標(biāo)記，Adscs仍然難以鑒別。Mizuno等人發(fā)現(xiàn)，Adscs相關(guān)標(biāo)記物包括CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166，其在血管基質(zhì)成分(SVF)細(xì)胞中最初表達(dá)較低，但會(huì)隨連續(xù)傳代的增加而顯著增加[10]。因此在考慮通過(guò)表面標(biāo)志物來(lái)鑒定Adscs時(shí)也需要考慮傳代次數(shù)等因素。Adscs免疫表型表面標(biāo)記中陽(yáng)性表達(dá)的因子有CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59，陰性表達(dá)的因子有CD31、CD34、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。

2 脂肪組織的提取及分離

2.1脂肪組織的提取方法 脂肪組織主要存在于所有組織和器官的血管周圍區(qū)域，這些區(qū)域的Adscs含量較高，通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)很容易獲得，使其成為基于細(xì)胞治療中的合適靶點(diǎn)。通過(guò)脂肪抽吸手術(shù)獲得大量脂肪組織，相比采集骨髓干細(xì)胞，其痛苦和創(chuàng)傷相對(duì)較小[11]。腹部淺表脂肪組織有較強(qiáng)的多能性和干性特征,標(biāo)準(zhǔn)的整塊切除和脂肪抽吸是兩種最常見(jiàn)用于獲取脂肪組織的手術(shù)方法。

2.2脂肪組織的分離 獲取脂肪組織是分離Adscs的第一步。第一次分離Adscs是通過(guò)適當(dāng)洗滌，使用1型膠原酶消化，離心分離血管基質(zhì)成分細(xì)胞(Stromal vascular fraction SVF)。SVF被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞、Adscs以及其他細(xì)胞的來(lái)源，離心速度會(huì)影響細(xì)胞產(chǎn)量，1 200 g被認(rèn)為是最佳離心速度。通過(guò)迭代培養(yǎng)，獲取貼壁生長(zhǎng)的Adscs[12]。目前尚無(wú)統(tǒng)一的Adscs培養(yǎng)方法，在開(kāi)始培養(yǎng)Adscs前，可以洗滌去除血液或其他殘留細(xì)胞[13]。

3 Adscs成骨分化的影響因素

在某些因素下，Adscs有可能分化為成骨細(xì)胞，為在短時(shí)間內(nèi)解決骨相關(guān)疾病提供機(jī)會(huì)[14]。誘導(dǎo)Adscs成骨的因子包括地塞米松、抗壞血酸/抗壞血酸2-磷酸、膽囊鈣素和β-甘油磷酸酯，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、維生素D3和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等[15-16]。也有研究表明一種天然的黃酮類化合物——槲皮素，通過(guò)增強(qiáng)Osx、Runx2、BMP-2、Col-1、OPN和OCN等基因的作用，促進(jìn)小鼠和人Adscs的成骨[17]。Adscs的成骨分化也受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如核心結(jié)合因子1α(CBF-1α)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、Osterix蛋白、同源盒蛋白Hox-B7(HOXB7)、Hoxa2、Hoxa9、核心結(jié)合因子β(Cbf-β)、溶血性增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2β(Pebp2β)、Sox9、TNF-α、FOXC2、PPARγ、YAP、MyoD、BMP9、β-cat GATA4和GATA6[18]。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、Notch信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等被認(rèn)為是調(diào)節(jié)Adscs成骨分化潛能的主要信號(hào)通路[19]。

3.1地塞米松、β-甘油磷酸酯和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A) 地塞米松通過(guò)激活FHL2/β-catenin通路，誘導(dǎo)RunX2和I型膠原α1(COL1A1)的過(guò)度表達(dá)；β-甘油磷酸酯則提供磷酸鹽，增加成骨基因的表達(dá)[20]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)在骨再生中起著重要作用，因?yàn)樗瑫r(shí)具有促進(jìn)人Adscs血管生成和成骨的潛力，Behr等使用VEGF聯(lián)合Adscs局部治療小鼠顱骨缺損，相比對(duì)照組，使用VEGF處理的Adscs能改善嚴(yán)重顱骨缺損的愈合，并且這種修復(fù)伴隨著血管的生成而增強(qiáng)[21]。VEGF和BMP-2、4、6、9可通過(guò)表達(dá)成骨堿性磷酸酶基因促進(jìn)成骨來(lái)進(jìn)行聯(lián)合治療[22]。也有研究表明，缺氧除了促進(jìn)血管生成外，還被證實(shí)可增強(qiáng)成骨潛能。缺氧條件下，IGFBP3的活化會(huì)抑制Adscs的成骨潛能，缺氧還會(huì)抑制堿性磷酸酶活性、核心結(jié)合因子α1(CBFA-1)和骨橋蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致Adscs成骨潛能的負(fù)調(diào)控[23]。因此，在缺氧條件下Adscs的成骨分化潛能需要更多研究來(lái)證實(shí)。

3.2骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs) 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一種細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，可用于誘導(dǎo)Adscs的成骨分化。BMP-2和BMP-7的臨床意義在澳大利亞、美國(guó)和歐洲等地區(qū)得到廣泛認(rèn)可。BMP-2、BMP-6和BMP-14被認(rèn)為是Adscs成骨分化的主要因素，BMP-7則促進(jìn)軟骨形成和成骨[24]。也有人認(rèn)為，BMP本身不足以指導(dǎo)MSCs分化為成骨譜系，因?yàn)樗韵嗤乃俣韧瑫r(shí)觸發(fā)脂肪生成和成骨。具體來(lái)說(shuō)，BMP信號(hào)通路通過(guò)配體與異二聚體絲氨酸/蘇氨酸激酶BMP受體的結(jié)合而激活，從而觸發(fā)Smad依賴的信號(hào)通路(Smad1/5/8)和Smad無(wú)關(guān)的信號(hào)通路(JNK)的激活，最終介導(dǎo)脂肪生成和成骨[25]。Smad4與磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Smad1、Smad5或Smad8的異二聚體激活A(yù)dscs成骨促進(jìn)基因的表達(dá)。

3.3Wnt/β-catenin信號(hào)通路 Wnt家族由大量分泌性糖基蛋白組成，其廣泛參與胚胎發(fā)育、組織誘導(dǎo)分化和體軸分化。大多數(shù)Wnt蛋白被認(rèn)為是由膜受體卷曲蛋白(Fz)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)家族成員組成的細(xì)胞表面受體復(fù)合物的配體。在FzLRP5/6復(fù)合物的下游，典型的Wnt信號(hào)將β-catenin穩(wěn)定和易位到細(xì)胞核，從而與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(TCF)/Lef轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。β-catenin-TCF/Lef復(fù)合物能激活多種Wnt反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，包括參與細(xì)胞增殖、成骨細(xì)胞分化和成骨基因表達(dá)等[26]。德雷可夫斯基等發(fā)現(xiàn)Notch-1過(guò)度表達(dá)是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而不是BMPs信號(hào)來(lái)抑制成骨細(xì)胞發(fā)生，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，酒精不僅抑制成熟的成骨細(xì)胞活性，還能抑制Wnt信號(hào)通路以及β-catenin蛋白的表達(dá)，表明酒精可通過(guò)刺激氧化應(yīng)激抑制Wnt信號(hào)從而抑制骨形成[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，CCN1/Cyr61的表達(dá)可能在Wnt3A誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起重要作用，Wnt10b是人類和小鼠唯一與間充質(zhì)祖細(xì)胞功能相關(guān)的Wnt配體，也是維持成人骨間充質(zhì)干細(xì)胞活性所必須的信號(hào)[28]。還有一些研究表明，非典型Wnt信號(hào)也可能在成骨分化中發(fā)揮作用。例如涉及Ror2和RhoA的非經(jīng)典Wnt5a信號(hào)以及N-cadherin介導(dǎo)的β-catenin信號(hào)是機(jī)械誘導(dǎo)成骨分化所必需的，而Wnt-4可能在改善骨再生和修復(fù)顱面缺損方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Wnt5a可以誘導(dǎo)成骨分化，抑制PPAR-γ在Adscs中的表達(dá)，這一途徑激活β-catenin-T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(TC F)/Lef轉(zhuǎn)錄因子(Lef)，進(jìn)一步增強(qiáng)成骨[29]。

3.4Notch信號(hào)通路 典型的Notch信號(hào)當(dāng)細(xì)胞表面表達(dá)的Delta/Serate/LAG-2(DSL)配體與在相鄰細(xì)胞表面表達(dá)的Notch受體(Notch-1、-2、-3和-4)結(jié)合時(shí)啟動(dòng)。Notch信號(hào)在干細(xì)胞或是祖細(xì)胞的發(fā)育、再生以及控制其命運(yùn)中起著重要作用。人們普遍認(rèn)為，Notch系統(tǒng)較為保守的平衡了干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖和分化。以往的研究表明，Notch信號(hào)對(duì)ST-2骨髓基質(zhì)細(xì)胞、小鼠骨髓間充質(zhì)祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞M3T3-E1、間充質(zhì)祖細(xì)胞Kusa、C2C12成肌細(xì)胞和COS-7細(xì)胞等多種細(xì)胞的成骨分化有正調(diào)控作用[30]。當(dāng)腺病毒載體將Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞MC3T3E1細(xì)胞時(shí)，在長(zhǎng)期培養(yǎng)中觀察到鈣化結(jié)節(jié)的形成明顯增加。在原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中也觀察到類似的效果。當(dāng)用含有人N1ICD或其配體Jagged1的腺病毒載體轉(zhuǎn)染到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)物表現(xiàn)出鈣化作用。然而，當(dāng)顯性負(fù)性mastermind1蛋白與N1ICD或Jagged1共表達(dá)來(lái)抑制Notch信號(hào)時(shí)，細(xì)胞成骨分化的過(guò)程則會(huì)被部分延遲[31]。雖然Notch被證實(shí)在骨骼發(fā)育及修復(fù)中起著重要作用，但通過(guò)Notch信號(hào)誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成骨分化方面的研究仍較少，這可能是未來(lái)開(kāi)發(fā)新的骨組織再生及修復(fù)途徑之一。

3.5成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) 由于沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Adscs的特異性標(biāo)記物，所以很難確定影響Adscs在體內(nèi)自我更新的因素。FGF在體外Adscs培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)Adscs的自我更新起著重要作用。Zaragosi等報(bào)道，Adscs倍增時(shí)間的延長(zhǎng)與MSCs中FGF2表達(dá)的減少有關(guān)[32]。Adscs不表達(dá)FGF1，而表達(dá)FGFR1，這表明Adscs可能與FGF2更為親和。在20個(gè)傳代過(guò)程中，F(xiàn)GF2的加入增加了Adscs的增殖。與骨髓來(lái)源的MSCs相比，F(xiàn)GF2在Adscs中的表達(dá)更高，并通過(guò)增加初始增殖率促進(jìn)Adscs的成脂和成骨分化[33]。

4 Adscs在顱骨缺損修復(fù)中的作用

目前骨組織工程在顱骨缺損修復(fù)中的一大難題是如何改善工程骨在體內(nèi)的血運(yùn)。體內(nèi)Adscs處于低氧環(huán)境中，使其成為基于細(xì)胞治療的良好候選者，在植入后缺乏血液供應(yīng)時(shí)，氧供應(yīng)可能受到限制，導(dǎo)致工程骨植入后骨形成不良等問(wèn)題。課題組之前的研究表明，低氧預(yù)適應(yīng)/遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)可通過(guò)促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生，或分泌外泌體來(lái)提升神經(jīng)細(xì)胞的低氧耐受能力。本研究結(jié)果表明，Adscs經(jīng)歷低氧后成骨性基因蛋白質(zhì)表達(dá)有增高趨勢(shì)，因此通過(guò)低氧預(yù)適應(yīng)處理介導(dǎo)Adscs成骨也是一個(gè)具有前景的研究方向。Adscs能分泌血管生成細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，這些細(xì)胞因子被認(rèn)為是Adscs血管生成特性[34]。通過(guò)移植Adscs產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子，也可作為內(nèi)源性干細(xì)胞和祖細(xì)胞向損傷部位集結(jié)的信號(hào)。因此，Adscs的存在不僅可以促進(jìn)成骨分化，也可以促進(jìn)血管生成。

雖然Adscs已被證明可以用于修復(fù)顱骨缺損，但許多國(guó)家尚未批準(zhǔn)用于臨床，目前臨床使用案例較少。Thesleff等利用脂肪干細(xì)胞結(jié)合β-磷酸三鈣顆粒治療兩名顱骨缺損的患者，術(shù)后隨訪期間無(wú)臨床并發(fā)癥，并且復(fù)查頭顱CT也顯示令人滿意的骨化結(jié)果[35]。Sándor等用Adscs與Bmp2和β-磷酸三鈣顆粒結(jié)合治療1例因?yàn)槟[瘤切除而導(dǎo)致下頜骨大面積缺損的患者，成功進(jìn)行頜骨重建[36]。Adscs也可應(yīng)用于微血管重建，kmesim等報(bào)道1例采用Adscs、Bmp2以及β-磷酸三鈣顆粒用于修復(fù)上頜骨缺損的病例，在手術(shù)重建4個(gè)月后，生成成熟的骨組織以及血管結(jié)構(gòu)。Stefan等報(bào)道運(yùn)用Adscs、自體纖維蛋白膠以及支架聯(lián)合治療1例顱腦重度損傷合并顱骨大面積缺損的7歲小孩，術(shù)后病情平穩(wěn)，重建3個(gè)月后CT顯示新骨形成，顱骨連續(xù)性較為完整[37]。

5 總結(jié)

綜上所述，干細(xì)胞被定義為生物系統(tǒng)的組織單位，負(fù)責(zé)器官、組織的發(fā)育和再生，是先進(jìn)組織工程和細(xì)胞治療中不可或缺的工具。成人干細(xì)胞可以自體取材并應(yīng)用于自身。對(duì)于組織工程而言，成人干細(xì)胞可以播種在合成或自然衍生的支架上，并通過(guò)適當(dāng)?shù)闹Ъ芙M成、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和物理化學(xué)性質(zhì)的組合，以及適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)臋C(jī)械或電磁刺激來(lái)分化為所需的表型。對(duì)于細(xì)胞治療而言，干細(xì)胞以自分泌方式產(chǎn)生的生物活性分子，特別是生長(zhǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)分子可以直接應(yīng)用于受損組織。在成人干細(xì)胞中，脂肪組織干細(xì)胞被認(rèn)為是最有前景的細(xì)胞類型，因?yàn)槠銩dscs分離簡(jiǎn)單、相對(duì)安全。而脂肪組織被認(rèn)為是Adscs最方便和最豐富的來(lái)源，具有易于獲取和較少的倫理復(fù)雜性，使Adscs成為再生治療方法中最合適的干細(xì)胞來(lái)源。同時(shí)Adscs在適宜的刺激因素下可以進(jìn)行成骨分化，從而修復(fù)骨缺損，因此Adscs在治療顱骨包括顱面骨的缺損方面是可行的，并且這方面的臨床研究以及實(shí)驗(yàn)正在不斷取得進(jìn)展。但由于Adscs目前缺乏一個(gè)統(tǒng)一高效的培養(yǎng)方法，并且Adscs等其他干細(xì)胞所產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、免疫抑制因子和其他生物活性分子可能對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)存在一定支持作用，所以仍存在較大挑戰(zhàn)。隨著Adscs鑒定、分離、培養(yǎng)以及定向誘導(dǎo)其分化的方法不斷發(fā)展，可為未來(lái)臨床顱骨缺損修復(fù)提供效果非常好的治療途徑。