2 型糖尿病小鼠應(yīng)用環(huán)氧澤瀉烯對血糖水平的影響

魏 濤 范小娟

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)公共實驗研究中心 221000 2 江蘇省軍區(qū)徐州第三離職干部休養(yǎng)所門診部 221000）

糖尿病對人體健康存在嚴(yán)重危害，是一種常見代謝性疾病，2 型糖尿病患者人數(shù)較多，且患者多表現(xiàn)出高血糖癥狀。2型糖尿病由于無法根治，主要治療方式為降低以及控制患者血糖。2 型糖尿病由于受到多種因素的影響而導(dǎo)致人體內(nèi)的胰島素分泌不足，或是人體無法充分利用胰島素，繼而出現(xiàn)血糖水平持續(xù)升高的現(xiàn)象。當(dāng)人體長期處于高血糖狀態(tài)下時，人體的大血管、微血管以及神經(jīng)均會出現(xiàn)不同癥狀的病變，對人體器官造成影響，影響患者正常生活，嚴(yán)重情況下威脅患者身體健康。中藥澤瀉能夠提取出良好的降糖活性，但是藥物具體降糖成分以及降糖機制并不明確。澤瀉的一種重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為倍半萜類化合物，該物質(zhì)基礎(chǔ)代表成分為環(huán)氧澤瀉烯，具有一定的抗炎效用。

本篇文章研究環(huán)氧澤瀉烯對血糖水平，建立2 型糖尿病小鼠模型，給予環(huán)氧澤瀉烯，分析小鼠血糖值變化?，F(xiàn)作如下報道。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

本次研究中所選取的小鼠鼠齡不足7 周，體重大約為21～23g，小鼠其他生命體征相同，并無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 細(xì)胞

小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞。

1.3 藥物與試劑

藥物：羅格列酮、鏈脲佐菌素、葡萄糖、煙酰胺、胰島素。

試劑：油紅O 和哈里斯氏蘇木精染劑、葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1，3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖（2-NBDG）、環(huán)氧澤瀉烯、胎牛血清、胰酶、低糖DMEM 培養(yǎng)基。

1.4 儀器

本次研究使用儀器為：羅氏血糖儀、熒光顯微鏡XTZ-Y3、IFS-110-8 型CO2恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 2 型糖尿病模型誘導(dǎo)

小鼠禁食過夜，注射240mg·kg-1煙酰胺，注射15 分鐘之后，注射100mg·kg-1鏈脲佐菌素，以此建立模型。

2 天后，再次采用腹腔注射的方式給予小鼠劑量相同的煙酰胺以及鏈脲佐菌素。

3 周后對小鼠空腹血糖值以及第22 天的口服葡萄糖耐受試驗期間的小鼠空腹血糖進(jìn)行測試，判斷2 型糖尿病模型誘導(dǎo)是否成功。相較于空白對照組，采用腹腔注射方式注射煙酰胺以及鏈脲佐菌素的小鼠空腹血糖值水平明顯高于11.1mmol·L-1，證明建模成功。小鼠模型分為三組，一組為模型組、一組為使用羅格列酮的小鼠、一組使用不同濃度的環(huán)氧澤瀉烯小鼠（5、10、20 mg·kg-1）。羅格列酮組濃度為10 mg·kg-1，環(huán)氧澤瀉烯組濃度分別5mg·kg-1、10mg·kg-1、20 mg·kg-1；上述每組各分配10 只小鼠，每只小鼠接受為期3 周的灌胃處理，同時還應(yīng)準(zhǔn)確測量小鼠體質(zhì)量以及血糖。灌胃主要采用生理鹽水以及10mg·kg-1羅格列酮，除此之外，還應(yīng)測定小鼠體重確定適宜環(huán)氧澤瀉烯劑量。

2.2 測定造模期間血糖濃度

在第一次為小鼠注射煙酰胺以及鏈脲佐菌素之前，采集20μL 的小鼠血液，給藥后，血液采集時間為7 天一次，測定小鼠血糖值。小鼠用藥22 天之后進(jìn)行耐量試驗，小鼠禁食過夜實施灌胃，灌胃方式為給予劑量相同的葡萄糖溶液，控制劑量為2mg·kg-1，在小鼠灌胃前以及灌胃后第30、60、120 分鐘對小鼠血液標(biāo)本進(jìn)行采集，分別測定小鼠血糖濃度。確定本次研究中的模型組，主要為血糖值測定兩次均高于11.1mmol·L-1的小鼠。

2.3 口服葡萄糖耐量試驗

試驗于灌胃后第22 天開展。小鼠禁食過夜實施灌胃，模型組以及常規(guī)組給予生理鹽水，采用10mg·kg-1羅格列酮對羅格列酮組實施灌胃，分別采用5、10、20mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯為環(huán)氧澤瀉烯組實施灌胃，2 小時后，采用2mg·kg-1的葡萄糖溶液為各組小鼠實施灌胃，分別于灌胃前以及灌胃后第30、60、120 分鐘采集血液標(biāo)本，對血糖濃度進(jìn)行測定。

2.4 環(huán)氧澤瀉烯測定2 型糖尿病小鼠降糖活性

用藥前以及用藥后均應(yīng)測量小鼠血糖水平，用藥后需按照間隔7 天的頻率進(jìn)行血糖測量。同時應(yīng)在實驗過程中，觀察小鼠使用不同濃度的環(huán)氧澤瀉烯后的血糖水平。

2.5 體重測定

分別記錄2 型糖尿病模型建立過程中以及建立后灌胃給藥過程中，各組小鼠體重變化狀況。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

放置培養(yǎng)基與培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基應(yīng)采用DMEM 培養(yǎng)基，并在其中加入血清，將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞放置其中。控制培養(yǎng)箱溫度為37℃，控制細(xì)胞培養(yǎng)箱中的二氧化碳濃度為5%。

2.7 油紅O 染色

誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞，使其分化。實際誘導(dǎo)操作：接種前脂肪細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)1 日之后，更換培養(yǎng)基為含血清培養(yǎng)基，并分別采用含有濃度為0.5、1μmol·L-1的環(huán)氧澤瀉烯或是含有濃度為0.5、1μmol·L-1羅格列酮的DEME 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 天。對照組小鼠細(xì)胞不需采用藥物進(jìn)行處理，直接用1μmol·L-1胰島素進(jìn)行處理。培養(yǎng)時間足夠12 天后，實施染色。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究涉及到的數(shù)據(jù)采用SPSS25.0 進(jìn)行錄入和統(tǒng)計分析，相關(guān)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間的差異比較采用配對樣本t 檢驗，血糖值采用單因素方差分析，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 建立2 型糖尿病模型期間的小鼠體重

對建立模型期間的小鼠進(jìn)行體重記錄，模型內(nèi)小鼠體重有所降低，降低差異較為明顯。

3.2 2 型糖尿病小鼠血糖受環(huán)氧澤瀉烯的影響

相較于2 型糖尿病模型組小鼠，羅格列酮給藥前以及給藥第7、14、21 的小鼠血糖明顯降低。不同濃度下，環(huán)氧澤瀉烯產(chǎn)生的降血糖活性不同。10mg·kg-1組高于5mg·kg-1劑量組，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且10mg·kg-1組與20mg·kg-1組達(dá)到的效果相近。

3.3 環(huán)氧澤瀉烯對2 型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受試驗的影響

實驗中第30 min 以及60min 時，羅格列酮組、環(huán)氧澤瀉烯組的血糖值有降低趨勢，且低于模型組。但與模型組進(jìn)行對比后可知，羅格列酮的降低趨勢更加顯著，而5mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯的降低趨勢并不顯著，這證實5mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯并不具有顯著降糖效果。

3.4 環(huán)氧澤瀉烯對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響

對小鼠前脂肪細(xì)胞分化狀況進(jìn)行記錄，在前脂肪細(xì)胞分化期間，羅格列酮具有良好的加速效果，不同濃度的環(huán)氧澤瀉烯也能促進(jìn)（0.5、1μmol·L-1）對前脂肪細(xì)胞分化，相較于羅格列酮，0.5、1μmol·L-1環(huán)氧澤瀉烯在促進(jìn)細(xì)胞分化中的濃度依賴趨勢更強。

4 討論

2 型糖尿病是一種較為復(fù)雜的代謝血糖疾病，是一種原發(fā)型疾病。大多數(shù)糖尿病患者呈現(xiàn)出2 型糖尿病病癥，該疾病患者群體多為中年人，年齡多在四十歲左右。目前現(xiàn)有的技術(shù)對該疾病無法進(jìn)行徹底根治，治療方式只能采取措施進(jìn)行緩解，降低患者血糖，緩解患者病情狀況。引起2 型糖尿病的因素較多，例如患者生活方式、不健康的飲食習(xí)慣，遺傳因素以及環(huán)境因素都可能會引發(fā)2 型糖尿病。

2 型糖尿病危害較大，對人體多個器官都有影響。對于患者腎臟的傷害，呈現(xiàn)在病情早期，早期2 型糖尿病患者血糖等指標(biāo)較高，腎臟循環(huán)功能受到影響，隨著病情的逐漸加重，出現(xiàn)腎衰竭現(xiàn)象，直接使腎臟功能受損，威脅病人健康。由2型糖尿病引發(fā)的腎臟功能缺失，是造成患者死亡的重要因素之一。除了腎臟功能受損，患者還會出現(xiàn)不同的并發(fā)癥，例如昏迷或是腦補功能受損，造成患者出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象，不能正常生活。

現(xiàn)階段，一般市面上用于治療2 型糖尿病的西藥，服用后患者表現(xiàn)出一定的不良反應(yīng)。使用中藥進(jìn)行加工處理，獲得的治療藥物具有更有高的治療效果，且副作用較小。在糖尿病的治療中重要具有顯著應(yīng)用前景。有研究指出，肽類、黃酮、苷類、生物堿等均具有良好的降糖活性，但是藥物具體活性物質(zhì)尚未明確。基于上述情況，在中藥資源中選取機制明確、活性物質(zhì)安全的藥物用于2 型糖尿病治療具有重要意義。在本研究中，將2 型糖尿病小鼠的體重作為參考值，采用環(huán)氧澤瀉烯進(jìn)行灌胃，小鼠血糖值低于給藥前血糖值，這提示環(huán)氧澤瀉烯在2 型糖尿病小鼠中具有顯著降糖效用。對小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實驗，羅格列酮的降低趨勢更加顯著，而5mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯的降低趨勢并不顯著。在脂肪細(xì)胞油紅O 染色實驗中，記錄小鼠細(xì)胞分化狀況，實驗結(jié)果顯示，環(huán)氧澤瀉烯濃度不同，產(chǎn)生的效果不同，如果濃度為0.5、1μmol·L-1，對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化有一定積極意義，對于胰島素敏感性能夠起到一定的強化效用。

綜上所述，環(huán)氧澤瀉烯具有顯著降糖效果，能夠促進(jìn)脂肪分化，但針對藥物的具體作用機制還需進(jìn)行深入研究。