非洲豬瘟環(huán)境樣品采樣監(jiān)測技術(shù)及應(yīng)用

李曼 魏小麗 張丹 徐鳳文 何莎

（陜西省安康市畜牧獸醫(yī)中心 725000）

非洲豬瘟（ASF）自2018 年在我國發(fā)生以來，對我國養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大的沖擊。雖然在廣大畜牧獸醫(yī)工作者的共同努力下，國內(nèi)生豬產(chǎn)能已在逐步恢復，但當前非洲豬瘟防控已成為常態(tài)化工作，面對不斷變化的防控形勢，我們要進一步提高認識，升級防疫措施，做好內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測，健全防控技術(shù)體系。目前規(guī)?；i場的防控重點主要是通過控制飼料、車輛及人員往來等環(huán)境因素來降低病毒傳染概率。因此，環(huán)境監(jiān)測是非洲豬瘟防控動物疫病的重要部分，是制定防控建設(shè)的重要依據(jù)。因此，對豬場周邊及內(nèi)部的環(huán)境進行跟蹤了解，制定系統(tǒng)的規(guī)范化環(huán)境樣品采集、保存、運輸程序，定期采集豬場的環(huán)境樣品，并進行病原學檢測可以及時發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情隱患，有效切斷病原傳播途徑，同時為非洲豬瘟防控決策提供科學依據(jù)。

1 非洲豬瘟防控中環(huán)境樣品的監(jiān)測意義

非洲豬瘟防控是一項系統(tǒng)工程，目前規(guī)模場的防控重點主要是通過建立完善的生物安全體系，按照要求規(guī)范操作來降低乃至杜絕病毒傳染的概率。而且病毒傳入僅從生產(chǎn)數(shù)據(jù)、臨床癥狀、病理解剖等外部信號無法得到準確信息，必須借助實驗室檢測結(jié)果的內(nèi)部信號來進行確認。目前部分大型養(yǎng)豬企業(yè)都建立了自己的ASFV 檢測實驗室，可以開展豬群非洲豬瘟疫情排查。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)養(yǎng)殖企業(yè)僅是監(jiān)測豬只，對環(huán)境樣品的采集監(jiān)測很少，且缺少合理規(guī)范的采樣技術(shù)規(guī)程。而人員、車輛、物質(zhì)等環(huán)境因素是非洲豬瘟傳播的主要方式，是我們生物安全防控的重中之重。環(huán)境樣品監(jiān)測技術(shù)是衡量生物安全體系是否完善，執(zhí)行是否規(guī)范的重要手段，因此，環(huán)境取樣檢測在非洲豬瘟防控工作中發(fā)揮著重要的作用，規(guī)范有效的采樣對了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況至關(guān)重要。

2 環(huán)境樣品監(jiān)測技術(shù)在非洲豬瘟防控工作中的應(yīng)用

2.1 日常防控中的應(yīng)用

非洲豬瘟防控是一項系統(tǒng)工程，目前規(guī)模場的防控重點主要是建立完善的生物安全體系，但我們不能拿豬場是否感染來判斷，需要環(huán)境取樣檢測來提供準確的監(jiān)測預警。規(guī)模場可以針對生產(chǎn)區(qū)、生活區(qū)，尤其是容易接觸到豬場外部環(huán)境的區(qū)域，如豬場大門口、運豬臺、人員進出通道、車輛、物質(zhì)、水源等，定期采集環(huán)境樣本進行熒光定量PCR 檢測。如若檢測結(jié)果為陰性，可根據(jù)養(yǎng)殖場規(guī)模及實際情況定期抽樣監(jiān)測。若檢測結(jié)果為陽性，要由里向外排查，分析病毒傳入具體原因，找出防控漏洞，根據(jù)情況及時整改，整改完成后再次采樣，直到檢測為陰性。

2.2 復養(yǎng)籌備工作中的應(yīng)用

經(jīng)過疫情的豬場要進行復養(yǎng)必須要經(jīng)過徹底消毒，評價消毒效果需要進行環(huán)境采樣監(jiān)測和引入哨兵豬。環(huán)境采樣監(jiān)測是復養(yǎng)籌備充分且必要的條件，引入哨兵豬則是充分非必要條件。引入哨兵豬僅能檢測舍內(nèi)凈化是否徹底，且必須保證足夠的活動空間和飼養(yǎng)時間。因此，環(huán)境檢測對復養(yǎng)至關(guān)重要，不可替代，環(huán)境采樣檢測可以對豬場內(nèi)外環(huán)境進行全面采樣，包括如圈舍、大門、走廊、用具、欄舍、出豬臺等處，通過全方位無死角的監(jiān)測，確保檢測的全面性和準確性。復養(yǎng)前的環(huán)境樣品檢測可以在消毒工作完成后和豬只進場前分兩次進行，消毒工作完成后采集樣品檢測結(jié)果如有陽性，應(yīng)立即對檢測陽性場所重新清洗消毒，然后再次采樣檢測，直到檢測結(jié)果陰性視為消毒合格。豬只進場前再次采集環(huán)境樣品檢測為陰性的可以恢復生產(chǎn)。

3 環(huán)境樣品采樣方法

非瘟防控是一個綜合、系統(tǒng)的生物安全體系，而日常監(jiān)測與監(jiān)控對生產(chǎn)具有關(guān)鍵性指導作用，監(jiān)測是否準確是非瘟防控的重點環(huán)節(jié)，但大規(guī)模、高頻率的采樣監(jiān)測增加了豬群應(yīng)激和感染風險。因此，非瘟防控尤其要把握好豬場進出口及周邊環(huán)境的監(jiān)測，同時提升監(jiān)測技術(shù)的靈敏度和特異性。每個豬場需要根據(jù)自身疫病壓力和條件制定合理的監(jiān)測體系。

樣品采集區(qū)域：根據(jù)病毒傳入風險程度和常見漏洞區(qū)域分為3 類，一類區(qū)域為豬舍內(nèi)部等不與外界接觸的生產(chǎn)區(qū)域（低風險區(qū)域），包括走（過道）、豬欄地面、豬欄欄桿、料槽、水槽、水嘴、風機、水簾、墻壁、生產(chǎn)工具、走廊溫控器、糞溝、趕豬道/豬道等。二類區(qū)域為豬舍外等與外界有部分接觸的區(qū)域（中風險區(qū)域），包括趕豬道/人道、道路、場內(nèi)卡/鏟車、豬只處死點、場內(nèi)掩埋點、出豬臺、藥房倉庫、飼料塔、下料口紗布、飼料堆放點、水源、工作人員、辦公室、停車場、物品消毒間等。三類區(qū)域為場外等與外界直接接觸的區(qū)域（高風險區(qū)域），包括大門口路面、公路路面、消毒中心等。此外還要做好“四害”監(jiān)測，因老鼠、蒼蠅、蚊子、蟑螂等“四害”無孔不入，無法做到實時監(jiān)測，而理論上都有機械帶毒的可能，建議當周邊有疫情時需加強除“四害”，尤其是老鼠，避免由發(fā)病豬場竄入。

采樣檢測周期：豬場應(yīng)根據(jù)周邊疫情壓力和場內(nèi)情況，制定合理監(jiān)測頻率，因場施策。根據(jù)豬場規(guī)模，與外界接觸即病毒傳入風險程度制定不同的采樣周期。高風險區(qū)域可根據(jù)外界人員、車輛、物資進出等情況隨時進行采樣監(jiān)測。中風險區(qū)域可根據(jù)與外界接觸時間、頻次進行采樣監(jiān)測，一般情況下可一周進行一次采樣。低風險區(qū)域可根據(jù)豬群健康情況進行采樣監(jiān)測，如豬有異常表現(xiàn)或出現(xiàn)死亡等情況時可隨時進行檢測。豬群如無異常情況可在豬轉(zhuǎn)群或進出豬時進行采樣監(jiān)測，其他時間可兩周或一月進行一次集中采樣監(jiān)測。

4 環(huán)境樣品采樣技術(shù)流程

由于環(huán)境樣品極強的空間性和時間性，要想正確了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況必須采集具有真實性和代表性的樣品。當樣品不具備真實性和代表性時，任憑實驗室分析工作再嚴密也無法彌補和改變樣品失真所致的嚴重影響即使測試質(zhì)量完全符合要求，而對于了解和評估環(huán)境質(zhì)量狀況也毫無意義，所以采樣是極其重要的一環(huán)。為此，必須切實重視采集樣品的質(zhì)量控制，使采集到的樣品符合計劃要求，是具有代表性和完整性的樣品。

4.1 豬場環(huán)境樣品的采集、編號與保存

豬場人員在進行采樣時應(yīng)做好個人防護措施（防護服、手套、鞋套、口罩等），準備必要的采樣工具（滅菌棉簽、生理鹽水、1.5ml 離心管、封口袋、記號筆等），涉及采樣的所有用品確保在有效的使用期限內(nèi)。每個采集樣品前填寫采樣表，并將離心管做好標記，編寫編號。樣品采集時要將棉簽用生理鹽水濕潤后采集，棉簽一支一采樣，采樣時不停的旋轉(zhuǎn)棉簽，保證接觸面積和采樣面積，采樣面積越大越容易發(fā)現(xiàn)目標病毒，從而最大程度的獲取病毒回收率。采集一個未經(jīng)采樣的棉簽樣品作為陰性對照。過程中注意避免液體濺出，每個樣品采集完畢后馬上蓋緊離心管蓋，采集樣品與其他采樣器具分別放置，以免造成交叉污染。

4.2 送檢樣品的包裝與運輸

將采集的環(huán)境樣品采用封口膜封口，放入密封性完好的封口袋中保存。采樣單應(yīng)用鋼筆或簽字筆逐項填寫，樣品標簽用記號筆填寫，采樣管用記號筆標記。不同品種和種類的樣品不應(yīng)混樣，在樣品袋外標記樣品名、樣品編號、采集日期等。采樣單和情況說明裝在塑料包裝袋中，并隨樣品送實驗室，每個樣品能對應(yīng)到來源。采樣完成后必須在適當溫度下以最快速度將樣品進行包裝、做好標記和相關(guān)記錄，以最快方式送往具有檢測資質(zhì)的實驗室。如樣品能在采集后24h 內(nèi)送達實驗室，則可放在4℃左右的容器中暫時存放。若在24h 內(nèi)不能將樣品送往實驗室，需將樣品放置于-20℃冷凍保存。如需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復凍融（凍融不超過3 次）。

4.3 廢棄物處理

采樣結(jié)束后，做好場地、物品、個人防護用品的消毒和無害化處理。對不同場點盡量安排不同的采樣人員，避免交叉污染。