雞傳染性喉氣管炎實驗室診斷技術

張雪梅 劉春青

(1，山東省濟南市動物疫病預防與控制中心 250109；2，山東省濟南市畜牧技術推廣站 250306）

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是一種嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要呼吸道疾病，該病的病原是傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）。我國自20 世紀50 年代發(fā)現(xiàn)本病，此后在多省份呈現(xiàn)流行性，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失，本病及時確診并采取相應的防控手段成為減少經濟損失的關鍵。對于雞群是否感染ILTV，根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化及流行病學特征可以做出初步診斷，但由于該病的臨床癥狀和剖檢變化與新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感、傳染性鼻炎和支原體病等呼吸道疾病有許多相似之處，易在臨床診斷過程中發(fā)生混淆，因此，實驗室診斷是確診雞傳染性喉氣管炎必需的。實驗室診斷ILTV 有多種方法，主要包括病毒分離、血清學檢測技術和分子檢測技術。

1 病毒分離鑒定

病毒分離是最敏感的病原學鑒定方法，通過將病毒接種到9～12 日齡的雞胚絨毛尿囊膜（CAM）上進行分離。樣品可以是疑似感染雞的口咽、氣管拭子或病死雞的喉頭、氣管和肺部等樣品。將處理后的樣品接種到CAM 上，感染后48h 可以觀察到痘斑，不同毒株在CAM 形成的痘斑大小和形態(tài)不同，2～12d雞胚就會死亡，再利用ILT 標準陽性血清和標準陰性血清與分離物做雞胚中和試驗，當陰性血清組和陽性血清組的EID50 的對數(shù)之差大于或等于2.5 時可判定為ILTV[1]。病毒分離鑒定的方法步驟煩瑣，所需時間較長，且需要大量雞胚進行試驗，已不能滿足快速檢測的需要。但目前ILTV 的分離主要還是通過將病料接種到雞胚CAM 和原代細胞的方法進行分離，同時雞胚還是繁殖ILTV 最常用的方法。

2 血清學檢測技術

血清學檢測技術依靠抗原抗體的特異性結合，對樣品中的抗原或抗體進行定性或定量的檢測技術。

2.1 瓊脂凝膠免疫擴散試驗

標準的瓊脂凝膠免疫擴散試驗使用抗原和標準陽性血清檢測樣品中的ILTV 抗體，具有操作簡便、快速等特點，能將ILT與雞痘、新城疫區(qū)分開來。瓊脂凝膠免疫擴散試驗是早期實驗室診斷ILT 的常用手段，但這種方法普遍敏感性較低，且由于性能不穩(wěn)定，目前已無相應產品供應。

2.2 血清中和試驗

經典的中和試驗是將抗血清與待檢病毒充分混合，在37℃溫箱中作用1h 后接種8～12 日齡的雞胚或細胞培養(yǎng)物，以正常血清加待檢病毒作為對照組，若抗血清能中和病毒，則判定為ILTV感染。中和試驗經濟方便，但某些弱毒株并不能被目前的標準強度抗血清中和，目前中和試驗已較少出現(xiàn)在常規(guī)實驗室診斷中。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

普通ELISA、間接ELISA、抗原捕獲ELISA 等方法都用來診斷ILT，實驗證明，ELSA 方法比病毒分離、瓊脂凝膠免疫擴散試驗和中和試驗更加敏感、快速和準確?，F(xiàn)在已有商業(yè)ELISA 試劑盒利用抗體檢測方法診斷ILT，具有較好的敏感性、特異性和重復性。

3 分子檢測技術

ILT 的分子檢測方法近年來得到迅速發(fā)展，DNA 分子檢測技術可以快速、準確的鑒別ILTV，且靈敏度很高，包括傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(PCR)、實時熒光定量PCR 及環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）等。利用分子檢測技術檢測ILTV 比病毒分離和血清學檢測方法更加敏感，而且能在樣本存在其他病原體污染的情況下鑒定出ILTV。

3.1 PCR 技術

目前，大部分獸醫(yī)實驗室已經建立起PCR 檢測方法，應用PCR 技術檢測ILTV 操作簡單、用時較少，且靈敏度高、特異性強，對樣品要求不嚴格，還能在潛伏感染階段檢測出病毒，是目前使用最廣泛的實驗室診斷手段。應用PCR 技術檢測ILTV 的DNA，引物序列的選取至關重要，一般以gB 基因、TK基因的一部分為參考序列，也有選取gC 基因、UL15、ICP4 等保守序列。

3.2 熒光定量PCR 技術

TaqMan 熒光定量PCR 和SYBR Green 熒光染料PCR 都已經被用來檢測ILTV，熒光定量PCR 技術的靈敏度高，最低能檢測到100 拷貝的病毒，且能定量分析臨床樣本中ILTV 的含量，對量化區(qū)分ILTV 在雞體不同組織的分布模式，測定不同時間感染雞群ILTV 含量有重要意義[2]。

3.3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)

LAMP 最先在2000 年被發(fā)明，目前也已被用于實驗室檢測ILTV[3]。相較于其他分子檢測技術，利用LAMP 檢測ILTV 靈敏度高，特異性強、反應時間短，僅需要水浴鍋或恒溫箱，操作簡單，可通過肉眼觀察或濁度儀對結果進行分析，但引物設計和篩選難度大，需要針對靶基因的6 個區(qū)域設計4 條特異性引物，且易出現(xiàn)假陽性等。

4 小結

ILT 是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要禽病，本病一旦發(fā)生，僅通過臨床癥狀和剖檢變化難以確診，快速可靠的實驗室診斷技術變得至關重要。文章總結了目前常見的ILT 實驗室檢測技術，包括病毒分離技術、血清學檢測技術和分子檢測技術，為不同場景下ILT 的診斷提供了理論依據(jù)，為有效控制該病的發(fā)生及防控提供了技術支撐。