浸種劑對水稻種子微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉元輝 徐春梅 陳松 褚光 章秀福 王丹英

（中國水稻研究所，杭州 310006；第一作者：liuyuanhui@caas.cn；*通訊作者：wangdanying@caas.cn）

水稻是世界上主要的農(nóng)作物之一，近一半人口以稻米為主食，其產(chǎn)量在維持全球糧食供應(yīng)方面起著核心作用[1]。目前，全球環(huán)境惡化及氣候變化等各種因素均增加了水稻病蟲害發(fā)生，威脅著全球糧食安全[2]。利用殺菌劑和殺蟲劑進(jìn)行種子處理，實現(xiàn)水稻早期病蟲害防治，對于減少農(nóng)藥使用量、保障水稻產(chǎn)量具有重要意義。種子處理是利用物理、化學(xué)和生物的方法和手段，主要包括浸種、拌種、種子包衣和種子丸?；?，為農(nóng)作物種子提供保護(hù)，促進(jìn)種子健康出苗。我國從20世紀(jì)50 年代就開始通過藥劑浸種、拌種來防治農(nóng)作物種傳病害[3-4]。咪酰胺為咪唑類廣譜殺菌劑，是一種高效、廣譜、低毒型殺菌劑，具有預(yù)防、保護(hù)、治療等多重作用；無內(nèi)吸作用，主要通過抑制麥角甾醇生物合成而起作用，對于子囊菌和半知菌引起的多種病害防效極佳。咪酰胺是水稻生產(chǎn)中常用的浸種劑，對水稻惡苗病、稻瘟病、紋枯病等具有良好的防治效果[5]。與此同時，有研究發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長有抑制作用[6]。那么，咪酰胺在抑制種子表面病原菌生長傳播的同時是否也抑制種子內(nèi)部有益微生物生長？

目前，浸種劑的研究主要集中于對水稻種傳病害的防治、種子萌發(fā)和幼苗生長等方面，其對水稻種子內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。因此，本研究利用高通量測序技術(shù)和微生物分離培養(yǎng)，分析了咪酰胺浸種對水稻種子表面真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為咪酰胺在水稻上的安全利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為秀水134；供試藥劑為25%咪酰胺，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)清水浸種（CK）和咪酰胺浸種（Soak）兩個處理，每個處理5 次重復(fù)。選取0.5 g 均勻完整的水稻種子，用2 mL 0.1% 咪酰胺浸泡種子36 h，然后用無菌去離子水洗掉表面殘余咪酰胺，加入30 mL 10 mM MgCl2超聲震蕩3 h，吸取 1 mL 上述浸提液，依次以10倍稀釋梯度稀釋，取10-2~10-4濃度的菌懸液100 μL 涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，每個濃度涂5 個培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)，每隔24 h 觀察1 次，選取合適的稀釋濃度統(tǒng)計培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)以驗證浸種劑對水稻表面真菌的影響。CK 用相同體積去離子水浸泡種子。為了研究浸種處理對水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的影響，首先對種子進(jìn)行表面消毒，然后按照上述方法進(jìn)行咪酰胺浸種和清水浸種，提取不同處理的種子DNA，并進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增子測序及分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 水稻表面真菌菌落計數(shù)

統(tǒng)計種子表面菌懸液在孟加拉紅培養(yǎng)基上長出的單菌落數(shù)目，計算平均每1 g 種子表面真菌數(shù)目。真菌數(shù)目=（真菌數(shù)目×稀釋倍數(shù)）/種子質(zhì)量。

1.3.2 種子表面消毒方法

挑取0.5 g 均勻完整的水稻種子，用滅菌的去離子水清洗 2 次；75% 乙醇 2 min；表面消毒液（20% 次氯酸鈉、3% 氯化鈉、0.1% 碳酸鈉、0.15% 氫氧化鈉混合液）搖床（150 rpm 搖 12 min），倒掉液體；75% 乙醇 30 s，生理鹽水洗滌7 次。為了排除種子表面微生物，將最后一遍的清洗液吸取100 μL 涂布在TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.3.3 DNA 提取，16S rRNA 基因擴(kuò)增子測序及分析

各個處理的種子轉(zhuǎn)移至無菌研缽中，用無菌的1 mL 10 mM MgCl2溶液磨碎。種子勻漿按照Mabio 植物DNA 小量提取試劑盒B 所示方法提取每個樣品的基因組DNA，使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis 分光光度計測定DNA 的濃度和純度。引物515 F（5‘-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3’） 和 806 R（5‘-GGACTA CVS GGG TAT CTA AT-3’） 被用于擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因的可變 V4 區(qū)。PCR 條件如下：94℃，5 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，30 個循環(huán)。使用Illumina 的NEBNext?UltraTMDNA 文庫制備試劑盒構(gòu)建測序文庫并添加index codes。使用Qubit @2.0 熒光計和Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估。在Illumina_Hiseq 2500 平臺上對該文庫進(jìn)行測序，并生成了長度為250 bp 的配對末端讀段。使用USEARCH v.11.06[7]對序列進(jìn)行合并，修剪，過濾，比對和聚類后得到操作分類單位（OTU）。通過USEARCH 中的UPARSE-OTU 算法將具有≥97%相似性的序列分配給同一OTU。并使用VSEARCH 2.11[8]進(jìn)行嵌合體檢測后去除。

1.4 統(tǒng)計分析

使用R 中的phyloseq 軟件包（版本3.6.0）通過負(fù)二項式模型對生成的OTU 表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。主坐標(biāo)分析是利用Bray-Curtis 距離評估處理之間微生物群落的差異。為了計算β 多樣性的顯著性，在vegan 中使用函數(shù)adonis 進(jìn)行了置換多變量方差分析（PERMANOVA）。Shannon、Chao 1 和 Fisher 指數(shù)以及觀察到的物種數(shù)量是使用R 包vegan 中的功能多樣性計算的，并進(jìn)行了Kruskal-Wallis 檢驗以評估處理之間的差異。采用R 包 agricolae 進(jìn)行 Fisher 最低顯著性（LSD）檢驗（p<0.05）。本研究中的所有數(shù)據(jù)均使用R 中g(shù)gplot2 和OriginPro 2017 生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪酰胺浸種對種子表面真菌的影響

選取稀釋倍數(shù)為1 000 倍平板統(tǒng)計，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，Soak 處理下水稻種子表面真菌的菌落數(shù)顯著降低，表明用咪酰胺浸種顯著抑制了水稻種子表面真菌的生長。

2.2 咪酰胺浸種對種子內(nèi)細(xì)菌群落多樣性的影響

為了確定咪酰胺浸種是否影響水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提取不同處理種子DNA，并使用16S rRNA基因的擴(kuò)增子測序來研究微生物群落特征。經(jīng)過質(zhì)量過濾和嵌合體去除后，從10 個樣品中獲得537 146 個序列（平均每個樣品53 715 個），并以97%的序列相似性鑒定出1 646 個微生物OTU。使用Shannon、Chao1和Fisher 指數(shù)以及觀察到的OTU（豐富度）數(shù)量來評估微生物群落α 多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK 種子內(nèi)細(xì)菌群落α 多樣性略高于Soak 處理，但差異不顯著（圖2）?；贐ray-Curtis 距離對種子內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析 （PCoA）和置換多變量方差分析（PERMANOVA），從圖3 可見，CK 和Soak 處理下水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落 β 多樣性差異不明顯（R2=12.54%，p=0.229）。

2.3 咪酰胺浸種對種子內(nèi)細(xì)菌群落組成的影響

分類學(xué)分析Soak 處理和CK 水稻種子內(nèi)占主導(dǎo)地位的細(xì)菌相對豐度的差異。如圖4 所示，在門分類水平下，相對豐度前20 的門在CK 和Soak 處理之間沒有顯著差異。其中，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度在Soak 處理和CK 分別占水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落71.36%和70.75%；放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度分別占17.78% 和 20.10%；擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度分別占3.17% 和3.02%。在屬分類水平下，部分屬的相對豐度在Soak 處理的水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落占比更高，但是差異不顯著。比如黃單胞菌屬（Xanthomonas）的相對豐度在Soak 處理和CK 分別占9.63%和9.23%；假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度分別占8.70%和5.82%；甲基桿菌屬（Methylobacterium）的相對豐度分別占8.54%和5.83%。同時，也有一些屬的相對豐度在CK 的水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落占比更高，差異不顯著。比如根瘤菌屬（Rhizobium）的相對豐度在Soak 處理和CK 下分別占水稻種子內(nèi)細(xì)菌群落17.24%和 22.12%；泛菌屬（Pantoea） 的相對豐度分別占11.16%和 11.65%；細(xì)桿菌屬（Microbacterium）的相對豐度分別占8.51%和12.04%。

3 討論與結(jié)論

咪酰胺浸種通過抑制種子表面真菌的生長從而實現(xiàn)防治種傳病害的目的，它對水稻惡苗病、稻曲病均有較好的防治效果[5，9-10]。況衛(wèi)剛等[11]采用菌株分離方法證實了咪酰胺對青稞種子攜帶真菌具有顯著抑制作用和消毒效果。這與本研究結(jié)果相吻合，咪酰胺浸種降低了水稻種子表面真菌數(shù)目。然而，咪酰胺浸種是一把雙刃劍，鄧接樓等[6]發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種降低了雜交水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，并抑制了幼苗生長。目前，咪酰胺浸種劑對種子內(nèi)細(xì)菌群落的多樣性及組成的研究較少。國際種子衛(wèi)生聯(lián)合會建立了一系列以種傳病原菌數(shù)量來評估種子質(zhì)量和純度的標(biāo)準(zhǔn)，各種植物檢疫措施，包括機械、熱、物理、生物和化學(xué)清洗種子的方法被廣泛使用[12]。并且，通常研究特定植物與微生物的相互作用時對種子進(jìn)行了表面消毒，以及分離培養(yǎng)種子微生物的挑戰(zhàn)導(dǎo)致科學(xué)家們長期認(rèn)為種子內(nèi)是無菌的，萌發(fā)期幼苗的微生物主要來源于周圍環(huán)境，特別是土壤[13]。本研究利用16S rRNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)分析種子內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咪酰胺浸種處理對水稻種子內(nèi)部細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢菌群比例沒有顯著影響。本試驗結(jié)果表明，咪酰胺浸種劑在抑制種子表面真菌的同時沒有影響內(nèi)部細(xì)菌群落，包括種子內(nèi)對植物生長有益的細(xì)菌群落。這為我們科學(xué)合理使用咪酰胺浸種防治水稻病害提供了理論依據(jù)。