金剛纂的化學(xué)成分研究

段云鳳，尹力玄，婁嘉豪，何 旎，王計(jì)宏，賴 祺，尹俊林，曾廣智

(云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

大戟屬(EuphorbiaL.)是大戟科(Euphorbieceae)植物中最大的一個(gè)屬，全世界有 2 000 余種，我國有80多種.大戟屬植物是重要的藥用植物，二萜酯類成分是大戟屬植物的主要活性成分，多數(shù)具有抗腫瘤、抗病毒、皮膚刺激以抗癌活性[1].

金剛纂(EuphorbianeriifoliaL.)，大戟科大戟屬植物，有小毒，是我國傳統(tǒng)的傣藥之一.其化學(xué)成分主要是二萜、三萜及黃酮類化合物，其中二萜類成分含量豐富，結(jié)構(gòu)類型多樣[2].金剛纂葉或莖具有清火解毒，消腫止痛，瀉下通便和殺蟲功效[3].目前，金剛纂化學(xué)成分的研究結(jié)果表明，該植物的主要成分為二萜類化合物，并以阿替生烷型二萜為主；三萜類成分的含量也較多，但是結(jié)構(gòu)變化不大；另外，該植物中還含有香豆素類化合物[4].金剛纂的藥理活性研究表明：金剛纂粗提物有乙酸乙酯相顯示出抑制 LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成，提示具有較好的抗炎活性[5]；金剛纂中分離得到的三萜化合物可抵抗HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變作用[6]；金剛纂中分離得到的二萜化合物針對一組人類癌細(xì)胞系，以紫杉醇為陽性對照做了藥理活性研究，顯示出具有抗癌活性[7].

為了細(xì)分金剛纂化合物成分研究，本文利用多種分離手段，對金剛纂甲醇提取物展開系統(tǒng)研究，得到12個(gè)化合物(見圖1)，豐富了其化合物的種類.并對單個(gè)化合物進(jìn)行了抗氧化活性研究，化合物10在 100 μmol/L 時(shí)具有一定的自由基清除能力.

圖1 化合物1 ～ 12的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

6420-TripleQuadLC/MS(Agilent Technologies，中國)；DRX-600型核磁共振儀(Bruker，瑞士)；NP7000泵-NU3000制備液相(江蘇漢邦，中國)；BS124S型電子分析天平(Sartorius，德國)；EYELA N-1300自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海圣科，中國).

柱色譜用硅膠(100 ～ 400目；青島海洋，中國)；Sephadex LH-20(GE Healthcare，美國)；薄層色譜硅膠板GF254(青島海洋，中國)；色譜級甲醇(霍尼韋爾，美國)，純凈水(娃哈哈，中國)；其它化學(xué)試劑均為分析純(上海科技，中國)；顯色劑：5%硫酸-乙醇溶液(105 ℃ 加熱顯色)、10%磷鉬酸-乙醇溶液和茴香醛顯色劑.

1.2 植物材料

金剛纂樣品于2019年03月購于四川省涼山州木里縣白碉鄉(xiāng)，藥材經(jīng)昆明采智技術(shù)有限公司鑒定為金剛纂(EuphorbianeriifpliaL.)全株.標(biāo)本保存于云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

1.3 提取與分離

金剛纂(27 kg)用95%甲醇提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏 2.5 kg.將浸膏懸浮于適量水中，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次分別萃取3次，合并濃縮得石油醚部分浸膏 140.62 g，乙酸乙酯部分浸膏 358.88 g，正丁醇部分浸膏 210.7 g.石油醚部分用60 ～100目硅膠 200 g 拌樣進(jìn)行柱色譜分離，洗脫梯度系統(tǒng)為石油醚∶二氯甲烷(體積比，25∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到8個(gè)組分，分別記為Fr.A～Fr.H.Fr.C(16.34 g)用MCI(甲醇∶水,體積分?jǐn)?shù)50%～100%)分離，得到4個(gè)組分Fr.C-1 ～ Fr.C-4，F(xiàn)r.C-3(3.15 g)經(jīng)反相中壓制備液相色譜、正相硅膠柱色譜柱分離，然后用Sephadex LH-20(甲醇)純化，得到化合物1(126 mg)和化合物2(39.2 mg).Fr.D(13.15 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚∶乙酸乙酯(體積比，30∶1～5∶1)梯度洗脫，得到5個(gè)組分Fr.D-1～Fr.D-5.組分Fr.D-2(1.502 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，得到化合物3(39.2 mg)和化合物4(68.9 mg).Fr.E(8.26 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離，得到3個(gè)組分Fr.E-1～ Fr.E-3.組分Fr.E-2(1.24 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，得到化合物5(11.3 mg)和化合物6(21.8 mg).Fr.E-3(3.060 8 g)用MCI(甲醇∶水,體積分?jǐn)?shù)70%～100%)分離，得到5個(gè)組分Fr.E-1～ Fr.E-5.Fr.E-3(906.7 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚∶乙酸乙酯(體積比，50∶1、5∶1)梯度洗脫，得到化合物7(31.6 mg).乙酸乙酯部分用60 ～100目硅膠 500 g 拌樣進(jìn)行柱色譜分離，洗脫梯度系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯(體積比，50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到6個(gè)組分，分別記為Fr.1～Fr.6.組分Fr.1(3.076 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用Sephadex LH-20(甲醇-二氯甲烷)純化，得到化合物8(7.9 mg)和9(6.5 mg).組分Fr.4(19.81 g)用MCI(甲醇∶水,體積分?jǐn)?shù)50%～100%)分離，得到5個(gè)組分Fr.4-a～ Fr.4-e.組分Fr.4-b經(jīng)反復(fù)柱層析，然后用Sephadex LH-20(甲醇)分離，得到化合物10(13.4 mg)和11(8.1 mg).Fr.5(17.809 g)經(jīng)硅膠柱層析后，用MCI(甲醇∶水,體積分?jǐn)?shù)60%～100%)分離，得到6個(gè)組分Fr.5-1～ Fr.E-6.組分Fr.5-4用HPLC(甲醇∶水，體積比75∶25；流速 1.0 mL/min)純化，分離得到化合物12(13.2 mg，tR=33.4 min).

1.4 化合物的抗氧活性研究

采用自由基清除反應(yīng)(DPPH )實(shí)驗(yàn)評價(jià)化合物的抗氧化活性.將化合物溶解于二甲基亞砜(DMSO)中備用，將稀釋好的樣品加入96孔板中，每孔 5 μL，之后加入用甲醇稀釋的 0.025 g/L 的DPPH 溶液，每孔 195 μL，混勻后室溫反應(yīng) 20 min 后用微孔板檢測器后于 515 nm 波長下檢測吸收值.同時(shí)設(shè)置DMSO組為陰性對照，根據(jù)以下公式計(jì)算化合物清除自由基DPPH·的百分有效率

其中NC為溶劑對照組；Sample為測試樣品組.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色結(jié)晶，分子式為C10H8O4，分子量=192.04.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=3.83(3H，s，-OCH3)，6.21(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，6.78(1H，s，H-8)，7.22(1H，s，H-5)，7.90(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，10.26(1H，s，OH).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=56.4(-OCH3)，103.2(C-8)，109.9(C-5)，110.9(C-10)，112.1(C-3)，144.9(C-4)，145.6(C-6)，149.9 (C-9)，151.5(C-7)，161.1(C-2).經(jīng)與文獻(xiàn)[8]對照，確定為東莨菪內(nèi)酯.

化合物2淡黃色油狀物，分子式為C6H6O3，分子量=126.03.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=4.51(2H，s，-CH2)，5.56(1H，s，-OH)，6.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，7.45(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，9.53(1H，s，-CHO).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=57.6(C-8)，110.0(C-4)，122.8(C-3)，152.3(C-2)，160.7(C-5)，177.7(C-1).經(jīng)與文獻(xiàn)[9]對照，確定為5-羥甲基-2-呋喃甲醛.

化合物3白色結(jié)晶，分子式為C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.83(3H，s，H-25)，0.96(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-30)，1.03(3H，s，H-27)，1.06(3H，s，H-24)，1.09(3H，s，H-26)，1.13(3H，s，H-23)，1.16(3H，s，H-28)，3.46(1H，br.s，H-3)，5.62(1H，d，J=8.78 Hz，H-6).13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ=16.2(C-25)，18.2(C-1)，18.4(C-26)，19.6(C-27)，23.6(C-7)，25.4(C-24)，27.8(C-2)，28.2(C-20)，28.9(C-23)，30(C-17)，30.3(C-12)，32.0(C-28，C-15)，32.4(C-30)，33.1(C-19)，34.5(C-29)，34.6(C-11)，34.8(C-9)，35.0(C-21)，36(C-22)，37.8(C-13)，38.9(C-16)，39.3(C-14)，40.8(C-4)，43(C-18)，47.4(C-8)，49.7(C-10)，76.3(C-3)，122.0(C-6)，141.6(C-5).經(jīng)與文獻(xiàn)[10]對照，確定為5(6)-gluten-3α-ol.

化合物4白色粉末，分子式為C32H52O2，分子量=468.39.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.83(3H，s，H-24)，0.85(3H，s，H-23)，0.85(3H，s，H-28)，0.86(3H，s，H-25)，0.94(3H，s，H-27)，1.02(3H，d，J=3.6 Hz，H-29)，1.03(3H，s，H-26)，2.05(3H，s，CH3CO)，4.48(1H，dd，J=1.0，6.0 Hz，H-3α)，4.61(2H，br.s，H-30).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.0(C-27)，14.6(C-25)，15.4(C-26)，15.9(C-24)，16.2(C-6)，18.3(C-29)，19.5(-OAc)，21.5(C-11)，25.5(C-2)，25.6(C-21)，26.2(C-12)，26.6(C-28)，27.4(C-15)，28(C-23)，34.1 (C-7)，34.5(C-17)，37.1(C-10)，38.3(C-4)，38.7(C-19)，38.8(C-1)，38.9(C-13)，39.2(C-16)，39.4(C-22)，40.9(C-8)，42(C-18)，48.7(C-18)，50.5(C-9)，55.4(C-5)，79.0(C-3)，107.1(C-30)，154.6(C-20)，170.9(-OAc).經(jīng)與文獻(xiàn)[11]對照，確定為蒲公英甾醇乙酸乙酯.

化合物5白色結(jié)晶，分子式為C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.77(3H，s，H-24)，0.79(3H，s，H-28)，0.84(3H，s，H-25)，0.97(3H，s，H-27)，0.98(3H，s，H-23)，1.04(3H，s，H-26)，1.69(3H，s，H-30)，3.18(1H，dd，J=10.8，4.7 Hz，H-3)，4.56(1H，s，H-29b)，4.69(1H，s，H-29a).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.5(C-27)，15.8(C-26)，16.0(C-25)，18.0(C-28)，19.8(C-3)，20.0(C-6)，21.0(C-24)，21.6(C-11)，25.2(C-12)，26.7(C-21)，27.5(C-15)，29.9(C-21)，33.6(C-7)，34.2(C-1)，35.6(C-16)，36.9(C-10)，38.2(C-13)，39.7(C-2)，40.0(C-22)，40.8(C-8)，43.0(C-17)， 43.0(C-14)，47.5(C-4)，48.0(C-19)，48.4(C-18)，49.8(C-9)，55.0(C-5)，109.4(C-29)，151.0(C-20)，218.32(C-30).經(jīng)與文獻(xiàn)[12]對照，確定為羽扇豆醇.

化合物6白色粉末，分子式為C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.73(3H，s，Me-24)，0.87(3H，s，Me-25)，0.88(3H，d，J=7.0 Hz，Me-23)，0.95(3H，s，Me-29)，1.00(3H，s，Me-30)，1.01(3H，s，Me-26)，1.05(3H，s，Me-27)，1.18(3H，s，Me-28).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=6.8(C-23)，14.7(C-24)，18.3(C-25)，18.7(C-7)，19.4(C-27)，20.3(C-26)，22.5(C-1)，28.3(C-20)，30.1(C-17)，30.6(C-12)，31.8(C-30)，32.2(C-28)，32.5(C-15)，32.9(C-21)，35.1(C-29)，35.4(C-19)，35.4(C-11)，35.7(C-16)，36.1(C-9)，37.6(C-13)，38.4(C-22)，39.8(C-14)，40.1(C-6)，41.4(C-2)，41.6(C-5)，42.4(C-18)，53.2(C-8)，58.4(C-4)，59.5(C-10)，214.0(C-3).經(jīng)與文獻(xiàn)[13]對照，確定為無羈萜.

化合物7白色結(jié)晶，分子式為C29H50O，分子量=414.36.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0. 69(3H，s，CH3-18)，0.79(3H，d，J=5.5 Hz，CH3-27)，0.81(3H，t，J=7.4 Hz，CH3-29)，0. 83(3H，s，CH3-19)，0. 84(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-26)，0. 91(3H，d，J=6. 0 Hz，H-21)，3. 55(1H，m，H-3)，5.01(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-23)，5. 13(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-22)，5. 36(1H，br.d，J=5. 0 Hz，H-6).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=11.9(C-18)，12.0(C-29)，18.8(C-21)，19.0(C-27)，19.1(C-19)，19.4(C-26)，19.8(C-11)，21.1(C-28)，23.1(C-15)，24.3(C-23)，26.1(C-16)，28.3(C-25)，29.1(C-2)，31.6(C-7)，31.9(C-8)，33.9(C-22)，36.2(C-20)，36.5(C-10)，37.3(C-1)，39.8(C-12)，42.2(C-13)，42.3(C-4)，45.8(C-24)，50.1(C-9)，56.1(C-17)，56.8(C-14)，71.7(C-3)，121.7(C-6)，140.8(C-5).經(jīng)與文獻(xiàn)[14]對照，確定為豆甾醇.

化合物8白色粉末，分子式為C31H52O，分子量=440.40.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.33，0.55(各1H，d，J=4.0 Hz，H-19)，0.81(3H，s，CH3-30)，0.89(3H，s，CH3-28)，0.90(2H，d，J= 6.4Hz，CH3-21)，0.97(6H，s，CH3-18，29)，1.02(3H，d，J=6.8 Hz，CH3-27)，1.03(3H，d，J=6.8 Hz，CH3-26)，3.29(1H，m，H-3).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.0(C-30)，18.0(C-18)，18.2(C-21)，19.3(C-28)，20C-9)，21.1(C-6)，21.8(C-26)，22.0(C-27)，25.4(C-29)，26.0(C-10，C-11)，26.4(C-16)，28.1(C-7)，29.9(C-19)，30.3(C-2)，31.3(C-23)，31.9(C-1)，32.9(C-15)，33.8(C-25)，35.0(C-22)，35.6(C-12)，36.1(C-20)，40.4(C-4)，45.2(C-13)，47.1(C-5)，47.9(C-8)，48.8(C-14)，52.2(C-17)，78.8(C-3)，105.9(C-31)，156.8(C-24).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對照一致，鑒定為環(huán)阿屯醇.

化合物9淡黃色粉末，分子式為C16H18O9，分子量=354.09.1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ=2.06(2H，ddd，J=14.1，9.0，6.7 Hz，H-6)，2.21(2H，ddd，J=17.0，13.6，2.5 Hz，H-2)，3.73(1H，dd，J=8.4，3.0 Hz，H-4)，4.16(1H，m，H-3)，5.33(1H，td，J=9.0，4.4 Hz，H-5)，6.26(1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，6.78(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.95(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.56(1H，d，J=16.2 Hz，H-7′).13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ=36.2(C-2)，37.1(C-6)，68.0(C-5)，70.3(C-4)，70.8(C-3)，73.4(C-1)，114.3(C-8′)，114.7(C-2′)，115.7(C-5′)，121.3(C-6′)，125.6(C-1′)，144.9(C-7′)，145.5(C-3′)，148.3(C-4′)，165.7(C-9′)，174.9(C-7).經(jīng)與文獻(xiàn)[16]對照，確定為綠原酸.

化合物10淡黃色固體，分子式為C27H30O16，分子量=610.15.1H NMR(400 MHz，CD3OD)：δ=1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6?，Rha-CH3)，3.55～3.24(8H，m，Glu-H-2″～5″，Rha-H-2?～5?)，3.63(1H，m，H-6″b)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6″a)，4.51(1H，d，J=1.6 Hz，Rha-H-1?)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，Glu-H-1″)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.38(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.61(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′).13C NMR(100 MHz，CD3OD)：δ=94.9(C-8)，100.0(C-6)，105.6(C-10)，116.1(C′-2)，117.8(C′-5)，123.1(C′-1)，123.6(C′-6)，135.6(C-3)，145.8(C′-3)，149.8(C′-4)，158.5(C-2)，159.4(C-9)，162.9(C-5)，166.0(C-7)，179.4(C-4)，Glu: 68.5(C″-6)，72.1(C″-4)，75.7(C″-2)，77.2(C″-5)，78.10(C″-3)，104.7(C″-1)，Rham: 17. 9(C?-6)，69.7(C?-5)，71.4(C?-3)，72.3(C?-2)，73.9(C?-4)，102.4(C?-1).經(jīng)與文獻(xiàn)[17]對照，確定為蘆丁.

化合物11白色粉末，分子式為C20H32O2，分子量=304.24.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.82(3H，s，H-20)，0.86(3H，s，H-19)，0.89(3H，s，H-18)，0.95(3H，d，J=6.9 Hz，H-16)，0.99(3H，d，J=6.9 Hz，H-17)，1.71(2H，ddd，J=14.9，12.8，2.2 Hz，H-6α)，1.78(2H，ddd，J=14.3，12.1，5.0 Hz，H-12α)，1.99(1H，dt，J=14.3，3.4 Hz，H-12β)，2.10(2H，ddd，J=14.9，3.9，1.5Hz，H-6β)，2.32(2H，br.s，H-14)，3.24(1H，t，J=2.0 Hz，H-7).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=15.7(C-11)，17.6(C-17)，17.8(C-16)，18.0(C-2)，19.9(C-20)，22.4(C-18)，22.9(C-6)，23.1(C-12)，32.5(C-4)，32.7(C-19)，33.1(C-15)，34.2(C-10)，39.3(C-1)，42.8(C-3)，44.3(C-5)，49.1(C-9)，53.9(C-7)，55.6(C-8)，62.5(C-14)，63.2(C-13).經(jīng)與文獻(xiàn)[17]對照，確定為roscotane D.

化合物12白色固體，分子式為C30H48O，分子量=424.37.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.80(3H，s，H-28)，0.94(3H，s，H-25)，0.96(3H，s，H-27)，1.04(3H，s，H-24)，1.08(6H，s，H-23，26)，1.68(3H，s，H-30)，4.57(1H，br.s，H-29a)，4.69(1H，br.s，H-29b).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=13.5(C-27)，14.7(C-26)，14.9(C-25)，17(C-28)，18.7(C-30)，19.2(C-6)，20(C-24)，20.4(C-11)，24.2(C-12)，25.7(C-23)，26.4(C-15)，28.8(C-21)，32.6(C-7)，33.1(C-1)，34.5(C-16)，37.7(C-13)，38.6(C-2)，38.9(C-22)，39.7(C-8)，41.8(C-17)，41.9(C-14)，46.3(C-4)，46.9(C-19)，47.3(C-18)，48.8(C-9)，53.9(C-5)，108.4(C-29)，149.9(C-20)，218.32(C-3).經(jīng)與文獻(xiàn)[12]對照，確定為羽扇烯酮.

2.2 化合物的抗氧活性研究

通過DPPH自由基清除反應(yīng)對化合物1～12的抗氧化能力進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示化合物10在 100 μmol/L 時(shí)具有一定的自由基清除能力，其對DPPH自由基清除的百分抑制率39.56%.

3 結(jié)語

本研究從金剛纂中分離得到12個(gè)化合物，分別為東莨菪內(nèi)酯(1)、5-羥甲基-2-呋喃甲醛(2)、5(6)-gluten-3α-ol(3)、蒲公英甾醇(4)、羽扇豆醇(5)、無羈萜(6)、豆甾醇(7)、環(huán)阿屯醇(8)、綠原酸(9)、蘆丁(10)、roscotane D(11)和羽扇烯酮(12).通過DPPH自由基清除反應(yīng)對化合物1～12的抗氧化能力進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示化合物10在 100 μmol/L 時(shí)具有一定的自由基清除能力，其對DPPH自由基清除的百分抑制率39.56%.本研究通過對金剛纂化學(xué)成分及抗氧化活性研究，進(jìn)一步豐富了金剛纂的化學(xué)成分，也為金剛纂作為民族藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ).