基因編輯技術(shù)及其在柞蠶基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用前景

諶苗苗 姜曉旭 鐘 亮 焦 陽(yáng) 徐 亮

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

柞蠶(Antheraeapernyi)屬鱗翅目大蠶蛾科昆蟲(chóng)，起源于中國(guó)，在我國(guó)有著2000多年的放養(yǎng)歷史，“柞林青葉壯蠶魄，山繭素綢平世窮”是中國(guó)柞蠶業(yè)內(nèi)容與功能的形象寫照[1]。柞蠶業(yè)是我國(guó)的一項(xiàng)傳統(tǒng)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，隨著柞蠶全基因組測(cè)序的完成，我國(guó)柞蠶基礎(chǔ)性研究也進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段，其關(guān)鍵性研究工作是對(duì)海量基因組序列信息的分析以及重要功能基因的解析，并且將遺傳信息和柞蠶表型或性狀相關(guān)聯(lián)，從而為今后的種質(zhì)資源遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

在分子生物學(xué)研究中，雖然可通過(guò)經(jīng)典遺傳學(xué)方法構(gòu)建遺傳群體，利用定位克隆法獲得功能基因的信息[2]，但柞蠶存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且需在野外放養(yǎng)，管理困難等問(wèn)題，難以滿足相關(guān)研究的開(kāi)展條件。目前，研究基因功能主要涉及兩種方法：一是通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、過(guò)表達(dá)等方法使目的基因在細(xì)胞或個(gè)體中產(chǎn)生基因表達(dá)水平的量變，觀察細(xì)胞或個(gè)體的反應(yīng)及變化來(lái)研究目的基因的功能[3]；二是通過(guò)基因編輯方法將目的基因在基因組中敲入、敲除或者是使其完全喪失功能，造成基因表達(dá)產(chǎn)物有無(wú)的質(zhì)變，觀察細(xì)胞或個(gè)體的反應(yīng)及表型變化，以鑒定目的基因的功能[4]。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于核酸內(nèi)切酶的基因靶向編輯技術(shù)，已成為基因功能研究的主流，并逐漸在生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究、人類疾病預(yù)防與治療以及經(jīng)濟(jì)物種遺傳改良等領(lǐng)域突顯其重要作用[5]。

1 基因編輯技術(shù)原理簡(jiǎn)述

基因編輯也稱基因組編輯或基因組工程，是指對(duì)基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行刪除、替換、插入等定向改造，獲得預(yù)期的生物體基因組序列發(fā)生遺傳性改變的技術(shù)。最早應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)是基于DNA雙鏈斷口(double strands breaks, DSBs)同源重組(homologous recombination, HR)的基因打靶。該技術(shù)需采用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES cell)進(jìn)行同源重組打靶，僅局限于有可嵌合遺傳ES細(xì)胞的動(dòng)物，且基因組中會(huì)殘留外源性基因。其后發(fā)展了3種基于人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease, EEN)的新型基因組靶向編輯技術(shù)，可依靠非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或HR等DSB修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶位點(diǎn)的定點(diǎn)改造。該類技術(shù)通過(guò)受精卵注射可直接得到突變個(gè)體，在物種間具有更好的通用性，同時(shí)避免了外源基因殘留的問(wèn)題，已被廣泛應(yīng)用于后基因組時(shí)代的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小鼠(Musmusculus)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶(Bombyxmori)等多種模式生物[6,7]。

1.1 鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)

第一代EEN基因靶向編輯技術(shù)——ZFN是由特異性識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)結(jié)構(gòu)域和非特異性切割DNA雙鏈的核酸酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域組成[8,9]。鋅指結(jié)構(gòu)域最初在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中發(fā)現(xiàn)，一般由串聯(lián)3～6個(gè)Cys2-His2 型ZFP組成，每個(gè)ZFP可特異性識(shí)別一個(gè)三聯(lián)體的DNA堿基組合[10]。一對(duì)ZFN以相對(duì)方向分別結(jié)合DNA雙鏈，當(dāng)兩個(gè)Fok I結(jié)構(gòu)域在間隔合適長(zhǎng)度(通常5～7 bp)的序列時(shí)，實(shí)現(xiàn)二聚化產(chǎn)生內(nèi)切酶活性切斷DNA雙鏈，然后主要借助NHE J等細(xì)胞內(nèi)源性DSB修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因定點(diǎn)編輯[11]。但是，至今尚未完全掌握Z(yǔ)FP同任意DNA靶序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，對(duì)一般研究者而言，獲得有效的ZFN仍是一個(gè)高成本的技術(shù)難題，因此也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)

第二代EEN基因編輯技術(shù)——TALEN與ZFNs類似，也是由識(shí)別特異性DNA序列的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE)蛋白結(jié)構(gòu)域和FokⅠ結(jié)構(gòu)域兩部分組成[12-15]。TALE最初是在黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)中被發(fā)現(xiàn)，是由33～35個(gè)氨基酸組成，其第12和13位為重復(fù)可變雙殘基 (repeat variable diresidue, RVD)，用于特異性識(shí)別并結(jié)合單個(gè)DNA堿基，其余氨基酸則高度保守[16]。TALE結(jié)構(gòu)域主要由3部分組成，C端為含有核定位信號(hào)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，中段為與DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N端為轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。其中，DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般由1～33個(gè)TALE重復(fù)串聯(lián)而成，末尾加入長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸的0.5個(gè)TALE。與ZFN不同，TALE與核苷酸1對(duì)1識(shí)別并結(jié)合的機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單，已明確4種不同堿基A、T、C和G對(duì)應(yīng)的RVD分別為NI(Asn Ile)、NG(Asn Gly)、HD(His Asp)和 NN(Asn Asn)[7,17]。一對(duì)TALEN的識(shí)別序列也需要間隔適當(dāng)?shù)拈g距(13～30 bp)以保證FokⅠ的切割活性，一般將FokⅠ連接在TALE結(jié)構(gòu)域的C端可獲得更高的切割活性[18]。與ZFN相比，TALEN更便于設(shè)計(jì)，研究成本較低，已廣泛應(yīng)用于多種模式生物。

1.3 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)相關(guān)核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)系統(tǒng)

第三代EEN基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9是由Cas9蛋白和單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA, sgRNA)組成，與ZFN、TALEN的原理不同，是基于堿基互補(bǔ)原則的靶標(biāo)序列互補(bǔ)RNA與靶標(biāo)序列DNA間的特異性結(jié)合[19,20]。CRISPR是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的獲得性免疫系統(tǒng)[21]，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為I—III三大類型[22]，其中源自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。包含DNA靶位點(diǎn)的引導(dǎo)序列與CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被加工為CRISPR RNA(crRNA)，與trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA)以部分區(qū)段堿基互補(bǔ)連接合成sgRNA，再與Cas9蛋白形成復(fù)合體，由crRNA中的特異性序列引至緊挨前體間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)的DNA靶位點(diǎn)，由引導(dǎo)序列(一般為20 bp)與靶位點(diǎn)DNA堿基互補(bǔ)結(jié)合并啟動(dòng)Cas9核酸酶切割DNA雙鏈，由Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈[23]，之后依靠NHEJ等修復(fù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯。較之ZFN和TALEN這種蛋白質(zhì)與DNA之間的互作，CRISPR/Cas9的原理更加簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，sgRNA的設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)易，并且可通過(guò)一次打靶完成多基因的編輯。該技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，因其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，脫靶率低，效率高，適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為基因組編輯的主流技術(shù)。

2 鱗翅目模式昆蟲(chóng)——家蠶的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用現(xiàn)狀

20世紀(jì)初，法國(guó)、日本及中國(guó)等學(xué)者先后利用家蠶驗(yàn)證了孟德?tīng)栠z傳定律，發(fā)現(xiàn)母性遺傳、連鎖遺傳及伴性遺傳規(guī)律，且在家蠶生理遺傳、形態(tài)遺傳研究領(lǐng)域取得不俗的成就，奠定了家蠶研究在遺傳學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)性[24]。直至近現(xiàn)代分子生物學(xué)時(shí)期，以基因工程和重組技術(shù)為主的眾多現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，推動(dòng)果蠅、小鼠、線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等發(fā)展為生物學(xué)研究的模式動(dòng)物，而家蠶因其自身的局限性，尤其是同源重組率低、穩(wěn)定性差等因素，基礎(chǔ)研究發(fā)展相對(duì)滯后，逐漸失去的分子生物學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)先地位[25]。

2.1 家蠶基因靶向編輯技術(shù)的建立

2010年Fujii等[26,27]通過(guò)轉(zhuǎn)基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明家蠶基因組Z染色體上的BmBLOS2基因的缺失或敲除突變是od家蠶幼蟲(chóng)呈現(xiàn)“油蠶”表型的根本原因。同年，Takasu等[28]利用ZFN首次實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶內(nèi)源基因的靶向編輯，在G1代獲得敲除BmBLOS2基因的純合突變家蠶個(gè)體。雖然該研究編輯效率不高(僅0.28%)，但對(duì)家蠶基因組靶向編輯研究的發(fā)展起到了里程碑式的作用，其后TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)在家蠶中的首次應(yīng)用，均采用突變體表型明顯、易于篩選的BmBLOS2基因作為靶標(biāo)基因[29]。此后的一些家蠶ZFN基因編輯研究均顯示ZFN在家蠶中的編輯效率低，設(shè)計(jì)高活性、高特異性的ZFN比較困難。2013年Wang等[30]和Takasu等[31]利用Golden Gate組裝體系建立了一套適用于家蠶的TALE組裝方法和基于胚胎的效率檢測(cè)體系。同年Wang等[32]通過(guò)顯微注射體外合成編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA，實(shí)現(xiàn)家蠶基因組編輯。2014年Liu等[33]構(gòu)建了基于質(zhì)粒DNA顯微注射的Cas9載體系統(tǒng)。自此，家蠶的TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)經(jīng)逐步完善，在后基因組時(shí)代極大地推動(dòng)了家蠶基因功能解析及家蠶素材創(chuàng)新研究的發(fā)展。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)因具有原理清楚、設(shè)計(jì)方便、載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為家蠶基因組編輯的主流技術(shù)。

2.2 家蠶基因組編輯的主要應(yīng)用類型

目前，家蠶基因組靶向編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于家蠶的未知內(nèi)源基因功能分析與鑒定[34]、絲腺生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)[35,36]、繭絲合成與分泌機(jī)制[37]、性別調(diào)控[38]、抗性育種[39]等研究領(lǐng)域。其實(shí)現(xiàn)基因組操作的主要類型包括：家蠶內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變、基因組結(jié)構(gòu)變異、外源基因在家蠶基因組定點(diǎn)整合與敲除等。

2.2.1 家蠶內(nèi)源基因定點(diǎn)突變

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在靶位點(diǎn)造成缺失或插入等基因突變，以介導(dǎo)靶位點(diǎn)內(nèi)源基因的敲除，是目前生物內(nèi)源編碼基因功能研究最常規(guī)、最主要手段之一[40]，主要集中于家蠶內(nèi)源基因基因功能驗(yàn)證、基因功能分析、定向改造突變體三個(gè)方面。

基因功能驗(yàn)證是以利用定位克隆在自然突變體中鑒定到的相關(guān)基因?yàn)榘谢?，在野生型中利用基因編輯技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，然后通過(guò)敲除后野生型與自然突變體表型變化對(duì)比分析來(lái)驗(yàn)證定位克隆的準(zhǔn)確性。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞色素沉淀相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因(apt-like)、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因(BmGC-I)[41]、血紅素過(guò)氧化物酶編碼基因(Bm-cardinal)及棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC18類似蛋白編碼基因(BmAPP)等進(jìn)行功能驗(yàn)證。

基因功能分析是以已鑒定功能基因的同源基因或通過(guò)信息分析獲得的未知內(nèi)源基因?yàn)榘谢颍没蚪M靶向編輯技術(shù)建立該靶基因定點(diǎn)敲除突變體，然后通過(guò)檢驗(yàn)敲除后突變個(gè)體表型、性狀等變化來(lái)分析靶基因的功能。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)蛻皮激素氧化酶基因(BmEO)[42]，家蠶翅發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因BmWnt-1及miR-2家族靶基因Bmawd和Bmfng，家蠶氣味共受體基因(BmOrco)和家蠶保幼激素酯酶基因(BmJHE)[43]等進(jìn)行功能分析。

定向改造突變體是以已明確功能的內(nèi)源基因?yàn)榘谢?，利用基因組靶向編輯技術(shù)獲得敲除靶基因并具有特定表型差異的突變體。如利用TALEN技術(shù)敲除家蠶BmdsxF基因建立的外生殖器和蠶卵發(fā)育異常的雌特異性不育家蠶系[38]，并在此基礎(chǔ)上利用CRISPR/Cas9進(jìn)一步證實(shí)BmPSI和BmMasc基因的突變影響B(tài)mdsx的剪切，導(dǎo)致雌性生殖器官出現(xiàn)在雄性外生殖器中[44]；通過(guò)TALEN技術(shù)敲除BmFib-H基因，創(chuàng)制可作為理想的生物反應(yīng)器的不分泌內(nèi)源Fib-H蛋白的“絲膠繭”突變體[35,36]；通過(guò)CRISPR/Cas9敲除家蠶胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因BmWnt1獲得蠶卵不孵化且體節(jié)發(fā)育和色素沉積異常突變體[45]等。

2.2.2 基因組結(jié)構(gòu)變異

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)同時(shí)對(duì)2個(gè)或2個(gè)以上的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，在基因組內(nèi)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)度大于1 kb的DNA片段的缺失、易位、重復(fù)、插入、倒位以及DNA拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)[40]。利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)的家蠶基因組結(jié)構(gòu)變異研究顯示，在胚胎中同時(shí)注射2對(duì)TALEN的mRNA時(shí)，可介導(dǎo)長(zhǎng)達(dá)8.9 Mb的染色體片段的刪除、翻轉(zhuǎn)和重復(fù)[46]，并獲得BmBLOS2基因序列區(qū)域約800 bp DNA片段缺失的人工突變體家蠶[47]。利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)了家蠶BmBLOS2基因區(qū)域長(zhǎng)度約3.5 kb DNA大片段的高效刪除，成功得到可穩(wěn)定遺傳的油蠶突變體[48]。利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體系統(tǒng)在家蠶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了BmBLOS2基因區(qū)域長(zhǎng)達(dá)3.2 kb DNA大片段的刪除和倒位等GSVs操作[33]。

2.2.3 外源基因的基因組定點(diǎn)整合

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在基因組特定位點(diǎn)造成雙鏈斷口，利用NHEJ或HR等DSB修復(fù)機(jī)制將外源基因定點(diǎn)敲入。利用ZFN介導(dǎo)產(chǎn)生DBS后，基于HR途徑實(shí)現(xiàn)了外源GFP基因在家蠶基因組的定點(diǎn)整合，但效率僅為0.0085%，暗示家蠶DSB修復(fù)主要通過(guò)NHEJ途徑實(shí)現(xiàn)[49]。此后利用以Bmku70基因?yàn)榘袠?biāo)的sgRNA表達(dá)載體與Cas9的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞，采用T7核酸內(nèi)切酶(T7EI)檢測(cè)基因型的結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效介導(dǎo)高達(dá)30.3%的靶基因編輯[50]。利用TALEN介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了攜帶同源臂序列的由組成型hr5-ie1啟動(dòng)子組合調(diào)控的DsRed2基因在家蠶BmBLOS2基因靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合[51]。根據(jù)基于微同源重組介導(dǎo)末端連接(microhomology mediated end joining, MMEJ)的修復(fù)途徑，利用TALEN和CRISPR/Cas9建立了結(jié)合目標(biāo)染色體精確整合(precise integration into target chromosome, PITCh)系統(tǒng)的外源基因整合策略(TAL-PITCh, CRIS-PITCh)，并實(shí)現(xiàn)了外源基因在家蠶BmBLOS2基因編碼區(qū)的定點(diǎn)整合[52]。

2.2.4 外源基因的點(diǎn)突變敲除

近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被用于進(jìn)行外源基因的點(diǎn)突變敲除。Dong等[53]在BmN-SWU1細(xì)胞中構(gòu)建了一種持續(xù)性或病毒誘導(dǎo)性定點(diǎn)敲除的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，可在病毒感染后被迅速激活，切割家蠶核型多角體病毒(BmNPV)復(fù)制早期必需基因ie-1，從而有效抑制病毒增殖，顯著地提高BmN-SWU1細(xì)胞抗BmNPV增殖的能力。Chen等[39]利用家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功建立了可持續(xù)性敲除BmNPV基因組ie-1基因和me53基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，添毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶具有顯著的抗BmNPV能力。

3 柞蠶基因編輯技術(shù)應(yīng)用展望

3.1 柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的路徑選擇

2014年由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所等6家柞蠶科研單位組成的柞蠶基因組研究聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目組與深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合作，利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)完成了柞蠶基因組de novo測(cè)序工作。2020年《Molecular Ecology Resources》雜志報(bào)道了利用第三代高通量測(cè)序技術(shù)完成柞蠶染色體基因組的組裝[54]。柞蠶基因組研究成果的公開(kāi)發(fā)表，標(biāo)志著柞蠶研究后基因組時(shí)代的開(kāi)啟，為進(jìn)一步解析柞蠶重要基因功能，明確關(guān)鍵基因的代謝通路等創(chuàng)造了條件。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，因其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單快速、易操作、省時(shí)省力、周期短，且適用于絕大多數(shù)物種的特點(diǎn)，迅速推動(dòng)了生物基因編輯研究的發(fā)展，已經(jīng)在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)、家蠶等昆蟲(chóng)的基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲(chóng)與模式生物，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)展基因編輯已經(jīng)取得顯著成果，柞蠶與家蠶相比存在著特性差異(柞蠶基因組重復(fù)序列異常豐富[54]、密碼子偏好差異等)與局限性(卵殼更厚、以蛹滯育、需野外放養(yǎng)等)，這些勢(shì)必會(huì)增加柞蠶基因組靶向編輯工作的難度，但相信CRISPR/Cas9系統(tǒng)一定能夠在柞蠶功能基因組研究中發(fā)揮重大作用。

3.2 內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率低的問(wèn)題

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于許多物種的基因組編輯研究，但由于物種間差異及特異性，該系統(tǒng)在不同物種間介導(dǎo)內(nèi)源基因定點(diǎn)敲除的效率差別較大。將Cas9蛋白mRNA及sgRNA導(dǎo)入發(fā)育早期的家蠶胚胎，獲得的內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率較低。為提高Cas9蛋白的瞬時(shí)表達(dá)效率與含量，目前有效的策略是采取密碼子優(yōu)化型Cas9蛋白編碼基因[50]，強(qiáng)啟動(dòng)活性、組成型或生殖腺等組織特異型啟動(dòng)子組合驅(qū)動(dòng)或持續(xù)驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白編碼基因表達(dá)[38,44,55]，以及構(gòu)建基于質(zhì)粒DNA的包含U6啟動(dòng)子的Cas9載體系統(tǒng)等方法提高敲除效率。

3.3 脫靶效應(yīng)問(wèn)題

基因組編輯的脫靶效應(yīng)是指EEN蛋白或sgRNA與非靶標(biāo)DNA序列發(fā)生錯(cuò)配，并引入非預(yù)期基因突變的現(xiàn)象。造成脫靶效應(yīng)的因素較為復(fù)雜，目前主要采取以下兩方面改善措施。首先，根據(jù)物種特性、靶位點(diǎn)序列特征等選擇適合的基因組編輯工具，并通過(guò)CRISPR Design和CRISPRdirect等在線軟件設(shè)計(jì)sgRNA、改變切口酶策略、采用新型Cas9蛋白、采用突變體Cas蛋白與FokⅠ形成的融合蛋白、采用細(xì)胞穿透肽來(lái)介導(dǎo)Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)入宿主細(xì)胞等方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。其次，就是建立簡(jiǎn)單、快速有效的脫靶效應(yīng)檢測(cè)方法。目前家蠶中主要應(yīng)用的仍是克隆檢測(cè)，此外基于高通量測(cè)序的ChIP-seq技術(shù)、GUIDE-seq技術(shù)、整合酶缺陷的慢病毒載體(IDLV)檢測(cè)法和Digenome-seq技術(shù)等都能夠檢測(cè)全基因組范圍的脫靶效應(yīng)[40]。

3.4 新型CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

近幾年公布了2種具有高效基因編輯能力的新型CRISPR基因編輯系統(tǒng)：CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas12b。它們與Cas9同屬于Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)，但在蛋白大小與結(jié)構(gòu)、PAM識(shí)別位點(diǎn)、靶向過(guò)程、靶標(biāo)序列剪切結(jié)果、位點(diǎn)特異性、脫靶率等方面有所差異，很好地彌補(bǔ)了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的局限性[56]，同樣適合應(yīng)用于家蠶基因組編輯研究?？梢灶A(yù)見(jiàn)，柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的應(yīng)用將有效促進(jìn)柞蠶業(yè)基礎(chǔ)科研水平的提高，推動(dòng)柞蠶品種的遺傳改良，提升柞蠶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等綜合利用潛力，鞏固我國(guó)柞蠶產(chǎn)業(yè)在世界上的領(lǐng)先地位。