• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基因編輯技術(shù)及其在柞蠶基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用前景

    2021-12-02 06:10:07諶苗苗姜曉旭
    北方蠶業(yè) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:柞蠶家蠶定點(diǎn)

    諶苗苗 姜曉旭 鐘 亮 焦 陽(yáng) 徐 亮

    (遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

    柞蠶(Antheraeapernyi)屬鱗翅目大蠶蛾科昆蟲(chóng),起源于中國(guó),在我國(guó)有著2000多年的放養(yǎng)歷史,“柞林青葉壯蠶魄,山繭素綢平世窮”是中國(guó)柞蠶業(yè)內(nèi)容與功能的形象寫照[1]。柞蠶業(yè)是我國(guó)的一項(xiàng)傳統(tǒng)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè),隨著柞蠶全基因組測(cè)序的完成,我國(guó)柞蠶基礎(chǔ)性研究也進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段,其關(guān)鍵性研究工作是對(duì)海量基因組序列信息的分析以及重要功能基因的解析,并且將遺傳信息和柞蠶表型或性狀相關(guān)聯(lián),從而為今后的種質(zhì)資源遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

    在分子生物學(xué)研究中,雖然可通過(guò)經(jīng)典遺傳學(xué)方法構(gòu)建遺傳群體,利用定位克隆法獲得功能基因的信息[2],但柞蠶存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng),且需在野外放養(yǎng),管理困難等問(wèn)題,難以滿足相關(guān)研究的開(kāi)展條件。目前,研究基因功能主要涉及兩種方法:一是通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、過(guò)表達(dá)等方法使目的基因在細(xì)胞或個(gè)體中產(chǎn)生基因表達(dá)水平的量變,觀察細(xì)胞或個(gè)體的反應(yīng)及變化來(lái)研究目的基因的功能[3];二是通過(guò)基因編輯方法將目的基因在基因組中敲入、敲除或者是使其完全喪失功能,造成基因表達(dá)產(chǎn)物有無(wú)的質(zhì)變,觀察細(xì)胞或個(gè)體的反應(yīng)及表型變化,以鑒定目的基因的功能[4]。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于核酸內(nèi)切酶的基因靶向編輯技術(shù),已成為基因功能研究的主流,并逐漸在生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究、人類疾病預(yù)防與治療以及經(jīng)濟(jì)物種遺傳改良等領(lǐng)域突顯其重要作用[5]。

    1 基因編輯技術(shù)原理簡(jiǎn)述

    基因編輯也稱基因組編輯或基因組工程,是指對(duì)基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行刪除、替換、插入等定向改造,獲得預(yù)期的生物體基因組序列發(fā)生遺傳性改變的技術(shù)。最早應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)是基于DNA雙鏈斷口(double strands breaks, DSBs)同源重組(homologous recombination, HR)的基因打靶。該技術(shù)需采用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES cell)進(jìn)行同源重組打靶,僅局限于有可嵌合遺傳ES細(xì)胞的動(dòng)物,且基因組中會(huì)殘留外源性基因。其后發(fā)展了3種基于人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease, EEN)的新型基因組靶向編輯技術(shù),可依靠非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或HR等DSB修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶位點(diǎn)的定點(diǎn)改造。該類技術(shù)通過(guò)受精卵注射可直接得到突變個(gè)體,在物種間具有更好的通用性,同時(shí)避免了外源基因殘留的問(wèn)題,已被廣泛應(yīng)用于后基因組時(shí)代的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小鼠(Musmusculus)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶(Bombyxmori)等多種模式生物[6,7]。

    1.1 鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)

    第一代EEN基因靶向編輯技術(shù)——ZFN是由特異性識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)結(jié)構(gòu)域和非特異性切割DNA雙鏈的核酸酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域組成[8,9]。鋅指結(jié)構(gòu)域最初在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中發(fā)現(xiàn),一般由串聯(lián)3~6個(gè)Cys2-His2 型ZFP組成,每個(gè)ZFP可特異性識(shí)別一個(gè)三聯(lián)體的DNA堿基組合[10]。一對(duì)ZFN以相對(duì)方向分別結(jié)合DNA雙鏈,當(dāng)兩個(gè)Fok I結(jié)構(gòu)域在間隔合適長(zhǎng)度(通常5~7 bp)的序列時(shí),實(shí)現(xiàn)二聚化產(chǎn)生內(nèi)切酶活性切斷DNA雙鏈,然后主要借助NHE J等細(xì)胞內(nèi)源性DSB修復(fù)機(jī)制,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因定點(diǎn)編輯[11]。但是,至今尚未完全掌握Z(yǔ)FP同任意DNA靶序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,對(duì)一般研究者而言,獲得有效的ZFN仍是一個(gè)高成本的技術(shù)難題,因此也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

    1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)

    第二代EEN基因編輯技術(shù)——TALEN與ZFNs類似,也是由識(shí)別特異性DNA序列的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE)蛋白結(jié)構(gòu)域和FokⅠ結(jié)構(gòu)域兩部分組成[12-15]。TALE最初是在黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)中被發(fā)現(xiàn),是由33~35個(gè)氨基酸組成,其第12和13位為重復(fù)可變雙殘基 (repeat variable diresidue, RVD),用于特異性識(shí)別并結(jié)合單個(gè)DNA堿基,其余氨基酸則高度保守[16]。TALE結(jié)構(gòu)域主要由3部分組成,C端為含有核定位信號(hào)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,中段為與DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域,N端為轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。其中,DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般由1~33個(gè)TALE重復(fù)串聯(lián)而成,末尾加入長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸的0.5個(gè)TALE。與ZFN不同,TALE與核苷酸1對(duì)1識(shí)別并結(jié)合的機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單,已明確4種不同堿基A、T、C和G對(duì)應(yīng)的RVD分別為NI(Asn Ile)、NG(Asn Gly)、HD(His Asp)和 NN(Asn Asn)[7,17]。一對(duì)TALEN的識(shí)別序列也需要間隔適當(dāng)?shù)拈g距(13~30 bp)以保證FokⅠ的切割活性,一般將FokⅠ連接在TALE結(jié)構(gòu)域的C端可獲得更高的切割活性[18]。與ZFN相比,TALEN更便于設(shè)計(jì),研究成本較低,已廣泛應(yīng)用于多種模式生物。

    1.3 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)相關(guān)核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)系統(tǒng)

    第三代EEN基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9是由Cas9蛋白和單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA, sgRNA)組成,與ZFN、TALEN的原理不同,是基于堿基互補(bǔ)原則的靶標(biāo)序列互補(bǔ)RNA與靶標(biāo)序列DNA間的特異性結(jié)合[19,20]。CRISPR是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的獲得性免疫系統(tǒng)[21],CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為I—III三大類型[22],其中源自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。包含DNA靶位點(diǎn)的引導(dǎo)序列與CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被加工為CRISPR RNA(crRNA),與trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA)以部分區(qū)段堿基互補(bǔ)連接合成sgRNA,再與Cas9蛋白形成復(fù)合體,由crRNA中的特異性序列引至緊挨前體間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)的DNA靶位點(diǎn),由引導(dǎo)序列(一般為20 bp)與靶位點(diǎn)DNA堿基互補(bǔ)結(jié)合并啟動(dòng)Cas9核酸酶切割DNA雙鏈,由Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈,而RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈[23],之后依靠NHEJ等修復(fù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯。較之ZFN和TALEN這種蛋白質(zhì)與DNA之間的互作,CRISPR/Cas9的原理更加簡(jiǎn)單、穩(wěn)定,sgRNA的設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)易,并且可通過(guò)一次打靶完成多基因的編輯。該技術(shù)問(wèn)世以來(lái),因其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單,脫靶率低,效率高,適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn),已逐漸成為基因組編輯的主流技術(shù)。

    2 鱗翅目模式昆蟲(chóng)——家蠶的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用現(xiàn)狀

    20世紀(jì)初,法國(guó)、日本及中國(guó)等學(xué)者先后利用家蠶驗(yàn)證了孟德?tīng)栠z傳定律,發(fā)現(xiàn)母性遺傳、連鎖遺傳及伴性遺傳規(guī)律,且在家蠶生理遺傳、形態(tài)遺傳研究領(lǐng)域取得不俗的成就,奠定了家蠶研究在遺傳學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)性[24]。直至近現(xiàn)代分子生物學(xué)時(shí)期,以基因工程和重組技術(shù)為主的眾多現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,推動(dòng)果蠅、小鼠、線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等發(fā)展為生物學(xué)研究的模式動(dòng)物,而家蠶因其自身的局限性,尤其是同源重組率低、穩(wěn)定性差等因素,基礎(chǔ)研究發(fā)展相對(duì)滯后,逐漸失去的分子生物學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)先地位[25]。

    2.1 家蠶基因靶向編輯技術(shù)的建立

    2010年Fujii等[26,27]通過(guò)轉(zhuǎn)基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明家蠶基因組Z染色體上的BmBLOS2基因的缺失或敲除突變是od家蠶幼蟲(chóng)呈現(xiàn)“油蠶”表型的根本原因。同年,Takasu等[28]利用ZFN首次實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶內(nèi)源基因的靶向編輯,在G1代獲得敲除BmBLOS2基因的純合突變家蠶個(gè)體。雖然該研究編輯效率不高(僅0.28%),但對(duì)家蠶基因組靶向編輯研究的發(fā)展起到了里程碑式的作用,其后TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)在家蠶中的首次應(yīng)用,均采用突變體表型明顯、易于篩選的BmBLOS2基因作為靶標(biāo)基因[29]。此后的一些家蠶ZFN基因編輯研究均顯示ZFN在家蠶中的編輯效率低,設(shè)計(jì)高活性、高特異性的ZFN比較困難。2013年Wang等[30]和Takasu等[31]利用Golden Gate組裝體系建立了一套適用于家蠶的TALE組裝方法和基于胚胎的效率檢測(cè)體系。同年Wang等[32]通過(guò)顯微注射體外合成編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA,實(shí)現(xiàn)家蠶基因組編輯。2014年Liu等[33]構(gòu)建了基于質(zhì)粒DNA顯微注射的Cas9載體系統(tǒng)。自此,家蠶的TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)經(jīng)逐步完善,在后基因組時(shí)代極大地推動(dòng)了家蠶基因功能解析及家蠶素材創(chuàng)新研究的發(fā)展。其中,CRISPR/Cas9技術(shù)因具有原理清楚、設(shè)計(jì)方便、載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn),已成為家蠶基因組編輯的主流技術(shù)。

    2.2 家蠶基因組編輯的主要應(yīng)用類型

    目前,家蠶基因組靶向編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于家蠶的未知內(nèi)源基因功能分析與鑒定[34]、絲腺生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)[35,36]、繭絲合成與分泌機(jī)制[37]、性別調(diào)控[38]、抗性育種[39]等研究領(lǐng)域。其實(shí)現(xiàn)基因組操作的主要類型包括:家蠶內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變、基因組結(jié)構(gòu)變異、外源基因在家蠶基因組定點(diǎn)整合與敲除等。

    2.2.1 家蠶內(nèi)源基因定點(diǎn)突變

    該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在靶位點(diǎn)造成缺失或插入等基因突變,以介導(dǎo)靶位點(diǎn)內(nèi)源基因的敲除,是目前生物內(nèi)源編碼基因功能研究最常規(guī)、最主要手段之一[40],主要集中于家蠶內(nèi)源基因基因功能驗(yàn)證、基因功能分析、定向改造突變體三個(gè)方面。

    基因功能驗(yàn)證是以利用定位克隆在自然突變體中鑒定到的相關(guān)基因?yàn)榘谢?,在野生型中利用基因編輯技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除,然后通過(guò)敲除后野生型與自然突變體表型變化對(duì)比分析來(lái)驗(yàn)證定位克隆的準(zhǔn)確性。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞色素沉淀相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因(apt-like)、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因(BmGC-I)[41]、血紅素過(guò)氧化物酶編碼基因(Bm-cardinal)及棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC18類似蛋白編碼基因(BmAPP)等進(jìn)行功能驗(yàn)證。

    基因功能分析是以已鑒定功能基因的同源基因或通過(guò)信息分析獲得的未知內(nèi)源基因?yàn)榘谢颍没蚪M靶向編輯技術(shù)建立該靶基因定點(diǎn)敲除突變體,然后通過(guò)檢驗(yàn)敲除后突變個(gè)體表型、性狀等變化來(lái)分析靶基因的功能。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)蛻皮激素氧化酶基因(BmEO)[42],家蠶翅發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因BmWnt-1及miR-2家族靶基因Bmawd和Bmfng,家蠶氣味共受體基因(BmOrco)和家蠶保幼激素酯酶基因(BmJHE)[43]等進(jìn)行功能分析。

    定向改造突變體是以已明確功能的內(nèi)源基因?yàn)榘谢?,利用基因組靶向編輯技術(shù)獲得敲除靶基因并具有特定表型差異的突變體。如利用TALEN技術(shù)敲除家蠶BmdsxF基因建立的外生殖器和蠶卵發(fā)育異常的雌特異性不育家蠶系[38],并在此基礎(chǔ)上利用CRISPR/Cas9進(jìn)一步證實(shí)BmPSI和BmMasc基因的突變影響B(tài)mdsx的剪切,導(dǎo)致雌性生殖器官出現(xiàn)在雄性外生殖器中[44];通過(guò)TALEN技術(shù)敲除BmFib-H基因,創(chuàng)制可作為理想的生物反應(yīng)器的不分泌內(nèi)源Fib-H蛋白的“絲膠繭”突變體[35,36];通過(guò)CRISPR/Cas9敲除家蠶胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因BmWnt1獲得蠶卵不孵化且體節(jié)發(fā)育和色素沉積異常突變體[45]等。

    2.2.2 基因組結(jié)構(gòu)變異

    該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)同時(shí)對(duì)2個(gè)或2個(gè)以上的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,在基因組內(nèi)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)度大于1 kb的DNA片段的缺失、易位、重復(fù)、插入、倒位以及DNA拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)[40]。利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)的家蠶基因組結(jié)構(gòu)變異研究顯示,在胚胎中同時(shí)注射2對(duì)TALEN的mRNA時(shí),可介導(dǎo)長(zhǎng)達(dá)8.9 Mb的染色體片段的刪除、翻轉(zhuǎn)和重復(fù)[46],并獲得BmBLOS2基因序列區(qū)域約800 bp DNA片段缺失的人工突變體家蠶[47]。利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)了家蠶BmBLOS2基因區(qū)域長(zhǎng)度約3.5 kb DNA大片段的高效刪除,成功得到可穩(wěn)定遺傳的油蠶突變體[48]。利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體系統(tǒng)在家蠶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了BmBLOS2基因區(qū)域長(zhǎng)達(dá)3.2 kb DNA大片段的刪除和倒位等GSVs操作[33]。

    2.2.3 外源基因的基因組定點(diǎn)整合

    該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在基因組特定位點(diǎn)造成雙鏈斷口,利用NHEJ或HR等DSB修復(fù)機(jī)制將外源基因定點(diǎn)敲入。利用ZFN介導(dǎo)產(chǎn)生DBS后,基于HR途徑實(shí)現(xiàn)了外源GFP基因在家蠶基因組的定點(diǎn)整合,但效率僅為0.0085%,暗示家蠶DSB修復(fù)主要通過(guò)NHEJ途徑實(shí)現(xiàn)[49]。此后利用以Bmku70基因?yàn)榘袠?biāo)的sgRNA表達(dá)載體與Cas9的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞,采用T7核酸內(nèi)切酶(T7EI)檢測(cè)基因型的結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效介導(dǎo)高達(dá)30.3%的靶基因編輯[50]。利用TALEN介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了攜帶同源臂序列的由組成型hr5-ie1啟動(dòng)子組合調(diào)控的DsRed2基因在家蠶BmBLOS2基因靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合[51]。根據(jù)基于微同源重組介導(dǎo)末端連接(microhomology mediated end joining, MMEJ)的修復(fù)途徑,利用TALEN和CRISPR/Cas9建立了結(jié)合目標(biāo)染色體精確整合(precise integration into target chromosome, PITCh)系統(tǒng)的外源基因整合策略(TAL-PITCh, CRIS-PITCh),并實(shí)現(xiàn)了外源基因在家蠶BmBLOS2基因編碼區(qū)的定點(diǎn)整合[52]。

    2.2.4 外源基因的點(diǎn)突變敲除

    近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被用于進(jìn)行外源基因的點(diǎn)突變敲除。Dong等[53]在BmN-SWU1細(xì)胞中構(gòu)建了一種持續(xù)性或病毒誘導(dǎo)性定點(diǎn)敲除的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng),可在病毒感染后被迅速激活,切割家蠶核型多角體病毒(BmNPV)復(fù)制早期必需基因ie-1,從而有效抑制病毒增殖,顯著地提高BmN-SWU1細(xì)胞抗BmNPV增殖的能力。Chen等[39]利用家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功建立了可持續(xù)性敲除BmNPV基因組ie-1基因和me53基因的轉(zhuǎn)基因家蠶,添毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶具有顯著的抗BmNPV能力。

    3 柞蠶基因編輯技術(shù)應(yīng)用展望

    3.1 柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的路徑選擇

    2014年由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所等6家柞蠶科研單位組成的柞蠶基因組研究聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目組與深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合作,利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)完成了柞蠶基因組de novo測(cè)序工作。2020年《Molecular Ecology Resources》雜志報(bào)道了利用第三代高通量測(cè)序技術(shù)完成柞蠶染色體基因組的組裝[54]。柞蠶基因組研究成果的公開(kāi)發(fā)表,標(biāo)志著柞蠶研究后基因組時(shí)代的開(kāi)啟,為進(jìn)一步解析柞蠶重要基因功能,明確關(guān)鍵基因的代謝通路等創(chuàng)造了條件。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)問(wèn)世以來(lái),因其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單快速、易操作、省時(shí)省力、周期短,且適用于絕大多數(shù)物種的特點(diǎn),迅速推動(dòng)了生物基因編輯研究的發(fā)展,已經(jīng)在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)、家蠶等昆蟲(chóng)的基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲(chóng)與模式生物,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)展基因編輯已經(jīng)取得顯著成果,柞蠶與家蠶相比存在著特性差異(柞蠶基因組重復(fù)序列異常豐富[54]、密碼子偏好差異等)與局限性(卵殼更厚、以蛹滯育、需野外放養(yǎng)等),這些勢(shì)必會(huì)增加柞蠶基因組靶向編輯工作的難度,但相信CRISPR/Cas9系統(tǒng)一定能夠在柞蠶功能基因組研究中發(fā)揮重大作用。

    3.2 內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率低的問(wèn)題

    盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于許多物種的基因組編輯研究,但由于物種間差異及特異性,該系統(tǒng)在不同物種間介導(dǎo)內(nèi)源基因定點(diǎn)敲除的效率差別較大。將Cas9蛋白mRNA及sgRNA導(dǎo)入發(fā)育早期的家蠶胚胎,獲得的內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率較低。為提高Cas9蛋白的瞬時(shí)表達(dá)效率與含量,目前有效的策略是采取密碼子優(yōu)化型Cas9蛋白編碼基因[50],強(qiáng)啟動(dòng)活性、組成型或生殖腺等組織特異型啟動(dòng)子組合驅(qū)動(dòng)或持續(xù)驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白編碼基因表達(dá)[38,44,55],以及構(gòu)建基于質(zhì)粒DNA的包含U6啟動(dòng)子的Cas9載體系統(tǒng)等方法提高敲除效率。

    3.3 脫靶效應(yīng)問(wèn)題

    基因組編輯的脫靶效應(yīng)是指EEN蛋白或sgRNA與非靶標(biāo)DNA序列發(fā)生錯(cuò)配,并引入非預(yù)期基因突變的現(xiàn)象。造成脫靶效應(yīng)的因素較為復(fù)雜,目前主要采取以下兩方面改善措施。首先,根據(jù)物種特性、靶位點(diǎn)序列特征等選擇適合的基因組編輯工具,并通過(guò)CRISPR Design和CRISPRdirect等在線軟件設(shè)計(jì)sgRNA、改變切口酶策略、采用新型Cas9蛋白、采用突變體Cas蛋白與FokⅠ形成的融合蛋白、采用細(xì)胞穿透肽來(lái)介導(dǎo)Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)入宿主細(xì)胞等方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。其次,就是建立簡(jiǎn)單、快速有效的脫靶效應(yīng)檢測(cè)方法。目前家蠶中主要應(yīng)用的仍是克隆檢測(cè),此外基于高通量測(cè)序的ChIP-seq技術(shù)、GUIDE-seq技術(shù)、整合酶缺陷的慢病毒載體(IDLV)檢測(cè)法和Digenome-seq技術(shù)等都能夠檢測(cè)全基因組范圍的脫靶效應(yīng)[40]。

    3.4 新型CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

    近幾年公布了2種具有高效基因編輯能力的新型CRISPR基因編輯系統(tǒng):CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas12b。它們與Cas9同屬于Ⅱ類CRISPR系統(tǒng),但在蛋白大小與結(jié)構(gòu)、PAM識(shí)別位點(diǎn)、靶向過(guò)程、靶標(biāo)序列剪切結(jié)果、位點(diǎn)特異性、脫靶率等方面有所差異,很好地彌補(bǔ)了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的局限性[56],同樣適合應(yīng)用于家蠶基因組編輯研究??梢灶A(yù)見(jiàn),柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的應(yīng)用將有效促進(jìn)柞蠶業(yè)基礎(chǔ)科研水平的提高,推動(dòng)柞蠶品種的遺傳改良,提升柞蠶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等綜合利用潛力,鞏固我國(guó)柞蠶產(chǎn)業(yè)在世界上的領(lǐng)先地位。

    猜你喜歡
    柞蠶家蠶定點(diǎn)
    吉林省柞蠶產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策思考
    家蠶原原種“871”“872”種性變化分析
    例談圓錐曲線中的定點(diǎn)定值問(wèn)題
    柞蠶繭系統(tǒng)分形研究
    遼寧絲綢(2022年1期)2022-03-29 00:58:38
    定點(diǎn)幫扶讓村民過(guò)上美好生活
    解析幾何中定點(diǎn)問(wèn)題的處理策略
    直線過(guò)定點(diǎn)的5種特優(yōu)解法
    抗BmNPV家蠶新品種“川抗1號(hào)”的育成
    家蠶猝倒病的發(fā)生與防治
    柞蠶新品種“川柞3號(hào)”選育報(bào)告
    国产成人精品无人区| 精品福利永久在线观看| 街头女战士在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费观看无遮挡的男女| 蜜桃国产av成人99| 一区福利在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 七月丁香在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 韩国高清视频一区二区三区| 人妻一区二区av| 午夜日本视频在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 高清视频免费观看一区二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 日本午夜av视频| 亚洲国产精品一区三区| 下体分泌物呈黄色| 欧美97在线视频| 国产av精品麻豆| 日本wwww免费看| 黄色怎么调成土黄色| 少妇熟女欧美另类| 久久综合国产亚洲精品| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品三级大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 天天影视国产精品| 免费观看av网站的网址| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久国产一区二区| 国产综合精华液| 日日摸夜夜添夜夜爱| av一本久久久久| 免费观看性生交大片5| 久久国产亚洲av麻豆专区| 天天操日日干夜夜撸| 成人黄色视频免费在线看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一级片'在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 色婷婷久久久亚洲欧美| 飞空精品影院首页| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲,欧美,日韩| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最新的欧美精品一区二区| 日本wwww免费看| 2018国产大陆天天弄谢| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本欧美国产在线视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 香蕉精品网在线| 丝袜喷水一区| 蜜桃在线观看..| 色94色欧美一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 尾随美女入室| 久久亚洲国产成人精品v| 国产在线免费精品| 亚洲人成77777在线视频| 精品福利永久在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲天堂av无毛| 国产成人免费观看mmmm| 大片电影免费在线观看免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 两个人看的免费小视频| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一区二区三区激情视频| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品美女久久av网站| 在线天堂中文资源库| 免费大片黄手机在线观看| 成人免费观看视频高清| 日本-黄色视频高清免费观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久人妻熟女aⅴ| 大陆偷拍与自拍| 九草在线视频观看| 亚洲国产精品999| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成人午夜精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 女性被躁到高潮视频| 国产av国产精品国产| 一级毛片电影观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品视频女| 男女下面插进去视频免费观看| 久久国产精品大桥未久av| 黄片小视频在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲伊人色综图| 一级a爱视频在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美另类一区| 国产男女内射视频| 七月丁香在线播放| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美xxⅹ黑人| 午夜福利在线免费观看网站| 午夜福利,免费看| 亚洲视频免费观看视频| 国产又爽黄色视频| 男女午夜视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 性色av一级| 一区福利在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲成人手机| 国产精品一区二区在线不卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品av久久久久免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 深夜精品福利| 国产探花极品一区二区| 亚洲国产日韩一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩精品网址| 国产 精品1| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美中文综合在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 丝袜在线中文字幕| 婷婷成人精品国产| 一区二区三区激情视频| 飞空精品影院首页| 亚洲少妇的诱惑av| 免费少妇av软件| 欧美在线黄色| 少妇的逼水好多| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 9色porny在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国精品久久久久久国模美| 久久午夜福利片| 美女视频免费永久观看网站| 欧美成人午夜免费资源| 飞空精品影院首页| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 999精品在线视频| 国产一级毛片在线| 午夜福利视频在线观看免费| 免费少妇av软件| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久av网站| 黑丝袜美女国产一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲人成电影观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产成人91sexporn| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲av福利一区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 大码成人一级视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产一区二区在线观看av| 最黄视频免费看| 两性夫妻黄色片| 五月伊人婷婷丁香| 日本色播在线视频| 日韩伦理黄色片| 国产成人91sexporn| 日日撸夜夜添| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品国产一区二区久久| 七月丁香在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久伊人网av| 亚洲av男天堂| 日韩三级伦理在线观看| 国产亚洲最大av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲情色 制服丝袜| 国产1区2区3区精品| 老司机影院成人| 久久人人爽人人片av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲图色成人| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 尾随美女入室| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 满18在线观看网站| 一级片免费观看大全| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 只有这里有精品99| 精品久久久久久电影网| 日韩制服骚丝袜av| 多毛熟女@视频| 深夜精品福利| 国产av码专区亚洲av| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩av在线免费看完整版不卡| 美女主播在线视频| 国产成人精品婷婷| 制服人妻中文乱码| 成人影院久久| 综合色丁香网| 不卡av一区二区三区| 韩国av在线不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 老汉色∧v一级毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲av中文av极速乱| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品午夜福利在线看| 午夜免费鲁丝| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久精品国产综合久久久| 韩国av在线不卡| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久久久久久久久大奶| 久久99蜜桃精品久久| 中国三级夫妇交换| 久久ye,这里只有精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 中文字幕人妻丝袜制服| 美女大奶头黄色视频| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产精品一区三区| 一本大道久久a久久精品| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲第一青青草原| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲最大av| 亚洲综合精品二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品久久久av美女十八| 久久精品国产亚洲av涩爱| 永久网站在线| 美女国产视频在线观看| 久久影院123| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲成人一二三区av| 一个人免费看片子| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线天堂中文资源库| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本色播在线视频| 在线观看国产h片| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩精品网址| 自线自在国产av| 国产伦理片在线播放av一区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美精品国产亚洲| 午夜日韩欧美国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 18禁国产床啪视频网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品偷伦视频观看了| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 大香蕉久久网| 高清黄色对白视频在线免费看| 26uuu在线亚洲综合色| 在线观看国产h片| videossex国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久a久久爽久久v久久| 看免费成人av毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 18+在线观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 国产免费又黄又爽又色| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人精品一,二区| 伦精品一区二区三区| av.在线天堂| 国产精品无大码| xxx大片免费视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 大片免费播放器 马上看| 午夜激情av网站| 999久久久国产精品视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费观看a级毛片全部| 国产成人91sexporn| 国产成人a∨麻豆精品| 曰老女人黄片| 高清在线视频一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 免费高清在线观看视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日日爽夜夜爽网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本91视频免费播放| 国产在线免费精品| 亚洲精品自拍成人| 777米奇影视久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲在久久综合| 亚洲美女黄色视频免费看| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲国产精品999| 这个男人来自地球电影免费观看 | 一级片'在线观看视频| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩电影二区| 久久久久久久久久久久大奶| 97在线视频观看| 欧美成人午夜精品| av视频免费观看在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 多毛熟女@视频| 免费黄色在线免费观看| 国产精品国产av在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久ye,这里只有精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美另类一区| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产一区有黄有色的免费视频| 人妻 亚洲 视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产在线免费精品| videosex国产| 国产成人精品久久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av男天堂| 在线观看免费高清a一片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久热久热在线精品观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩视频在线欧美| 深夜精品福利| 国产成人精品在线电影| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美人与善性xxx| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久国产一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 中文字幕亚洲精品专区| 观看美女的网站| 免费观看a级毛片全部| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲综合色惰| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美精品一区二区免费开放| 青青草视频在线视频观看| 亚洲三区欧美一区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 五月天丁香电影| 久久久精品免费免费高清| 伊人亚洲综合成人网| 国产片内射在线| 久久精品久久久久久久性| 高清视频免费观看一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人av激情在线播放| 婷婷成人精品国产| av有码第一页| 成人国产麻豆网| 午夜91福利影院| av在线老鸭窝| 香蕉丝袜av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 曰老女人黄片| av线在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 美女国产高潮福利片在线看| 久热这里只有精品99| 日韩av不卡免费在线播放| 两个人看的免费小视频| 久久久精品区二区三区| 久久av网站| 美女主播在线视频| 一本久久精品| 国产免费又黄又爽又色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 97在线视频观看| 一级黄片播放器| 亚洲在久久综合| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中国国产av一级| 久久久精品区二区三区| 国产在线视频一区二区| 久久精品国产自在天天线| 国产综合精华液| 如何舔出高潮| 亚洲成色77777| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费又黄又爽又色| 国产一区二区三区综合在线观看| 日本午夜av视频| 咕卡用的链子| 日韩视频在线欧美| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产成人精品婷婷| 国产精品免费视频内射| 亚洲第一av免费看| 亚洲在久久综合| 在线看a的网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲国产精品一区三区| 咕卡用的链子| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 永久免费av网站大全| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久久久久人妻| 国产黄频视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲伊人久久精品综合| 性色avwww在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产成人aa在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 三级国产精品片| 亚洲av电影在线进入| 国产精品 欧美亚洲| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| 青春草亚洲视频在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久狼人影院| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲四区av| 99re6热这里在线精品视频| 国产97色在线日韩免费| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产一区二区激情短视频 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 男人添女人高潮全过程视频| 91国产中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 少妇的逼水好多| 26uuu在线亚洲综合色| 女性被躁到高潮视频| 91精品三级在线观看| 色吧在线观看| 久久久精品区二区三区| 国产免费现黄频在线看| www.熟女人妻精品国产| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久亚洲精品成人影院| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久狼人影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇人妻 视频| 久久久久精品性色| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人国语在线视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品一区二区大全| 男男h啪啪无遮挡| 人妻一区二区av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美 日韩 精品 国产| 国产福利在线免费观看视频| 美女福利国产在线| 蜜桃在线观看..| 少妇的丰满在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 麻豆av在线久日| 一本久久精品| 免费大片黄手机在线观看| 777米奇影视久久| 久久久久久久国产电影| 一级,二级,三级黄色视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲av在线观看美女高潮| 高清黄色对白视频在线免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄片小视频在线播放| 亚洲av福利一区| 国产精品蜜桃在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 精品久久久精品久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产深夜福利视频在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 超碰成人久久| 成人免费观看视频高清| 精品一区在线观看国产| 日本91视频免费播放| 制服诱惑二区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线天堂最新版资源| 精品国产国语对白av| 国产成人精品福利久久| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品二区激情视频| 97在线视频观看| 国产xxxxx性猛交| 日本wwww免费看| av线在线观看网站| 美女主播在线视频| 婷婷成人精品国产| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇熟女欧美另类| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品久久久久久av不卡| 伦精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产色婷婷99| 日日撸夜夜添| 国产在线一区二区三区精| 人人妻人人澡人人看| 18禁动态无遮挡网站| 国产 一区精品| 激情视频va一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 男女免费视频国产| 欧美国产精品va在线观看不卡| 90打野战视频偷拍视频| 黄片播放在线免费| 99国产精品免费福利视频| 制服人妻中文乱码| 欧美黄色片欧美黄色片| 伦理电影免费视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 有码 亚洲区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品人妻久久久影院| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 老司机影院毛片| 亚洲人成77777在线视频| 精品久久蜜臀av无| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一级毛片 在线播放| 亚洲图色成人| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美日韩精品网址| 人成视频在线观看免费观看| 在线 av 中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黑丝袜美女国产一区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品欧美亚洲77777| 精品人妻在线不人妻| 又大又黄又爽视频免费|