熒光RNA：點(diǎn)亮神秘的基因組暗物質(zhì)

左方婷 楊弋

中心法則由弗朗西斯·克里克（F. Crick，1962年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎獲得者）于1958年提出，并于1970年豐富完善后在《自然》雜志（Nature）發(fā)表[1]。中心法則闡明了DNA、RNA以及蛋白質(zhì)三者之間的關(guān)系：DNA可自行復(fù)制，并將遺傳信息傳遞給RNA，再由RNA傳遞給蛋白質(zhì)。無論是DNA還是蛋白質(zhì)，在生命活動中都起到無可替代的作用，而起遺傳信息傳遞的RNA則看起來平平無奇。其實(shí)這種過分簡化的遺傳信息傳遞流程忽略了RNA在其中扮演的角色。由于長期以來人們對RNA的了解僅浮于表面，在活細(xì)胞上也難以對RNA進(jìn)行直接動態(tài)的觀察，所以RNA，特別是種類繁多的非編碼RNA也常被比喻成基因組中的暗物質(zhì)。

研究RNA的意義

有關(guān)基因組學(xué)的深入研究表明：人類的大多數(shù)基因組被轉(zhuǎn)錄成RNA，但只有小部分被翻譯成蛋白質(zhì)。初代中心法則中的RNA即指這種可以被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，稱為編碼RNA。我們所熟知的信使RNA（messenger RNA， mRNA）就是編碼RNA。通過對mRNA示蹤，研究mRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)，可以幫助科研人員獲得更多關(guān)于mRNA的信息。改變RNA的定位可能會引起疾病的發(fā)生。例如，罹患脆性X染色體綜合征的患者常表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和記憶障礙。這是因?yàn)榛颊甙l(fā)生基因突變，缺失與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的FMRP蛋白質(zhì)，導(dǎo)致mRNA無法正確定位而引起疾病。因此，通過對RNA動態(tài)成像可以為了解該疾病或其他類似疾病的機(jī)理提供新的見解。

除mRNA起到傳遞遺傳信息的功能外，RNA家族里還存在大量非編碼RNA（non-coding RNA， ncRNA）。細(xì)胞中含量最高的核糖體RNA（ribosomal RNA， rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA， tRNA）都屬于非編碼RNA，它們都能從基因組上轉(zhuǎn)錄出來，但是不翻譯成蛋白質(zhì)。此外，ncRNA還包括參與mRNA剪接的小核RNA（small nuclear RNA， snRNA）、參與RNA修飾的小核仁RNA（small nucleolar RNA， snoRNA），以及近年來發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）及microRNA等。大多數(shù)的ncRNA都是神秘的，與mRNA不同，ncRNA的序列僅能為它們潛在的功能提供很少的信息。因此，在細(xì)胞中對它們進(jìn)行示蹤顯得尤為重要。其中，可以通過成像確定ncRNA的亞細(xì)胞器定位，從而對它們的功能進(jìn)行預(yù)測。例如，細(xì)胞核中的ncRNA可能在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮功能，而細(xì)胞質(zhì)中的ncRNA可能會影響該區(qū)域的其他過程。除此之外，對特定位置或結(jié)構(gòu)的ncRNA的遷移進(jìn)行動力學(xué)追蹤，如細(xì)胞核中的卡哈爾體（Cajal body）或細(xì)胞質(zhì)中的P小體（P-bodies），都可用于預(yù)測ncRNA的功能或調(diào)節(jié)通路。

研究RNA的生物學(xué)功能意義深遠(yuǎn)，它能幫助我們逐步揭開神秘的基因組面紗，更好地了解生命活動的本質(zhì)。但是目前在研究RNA生物學(xué)功能上面臨著巨大的挑戰(zhàn)，缺乏能夠在活細(xì)胞中高效工作的RNA可視化工具便是一個(gè)技術(shù)瓶頸。

熒光RNA的開發(fā)背景

提到RNA的可視化工具，則不得不提到蛋白質(zhì)的可視化工具，其中遺傳編碼的熒光蛋白絕對占有重要的一席之地。2008年，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）的發(fā)現(xiàn)者下村修（O. Shimomura）、發(fā)現(xiàn)GFP具有熒光標(biāo)簽價(jià)值并將GFP的編碼基因成功表達(dá)在原核模式生物的查爾菲（M. Chalfie），以及對GFP加以改造得到一系列不同熒光光譜的熒光蛋白并推動其廣泛使用的錢永健，因?yàn)闊晒獾鞍准夹g(shù)的開發(fā)，共同獲得該年度諾貝爾化學(xué)獎。

綠色熒光蛋白來自維多利亞多管發(fā)光水母，野生型綠色熒光蛋白由238個(gè)氨基酸構(gòu)成。晶體學(xué)研究表明，綠色熒光蛋白是一個(gè)由11個(gè)β折疊環(huán)繞構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)，生色團(tuán)分子被α-螺旋固定在桶狀結(jié)構(gòu)的中心。該生色團(tuán)由Ser65-Tyr66-Gly673個(gè)氨基酸（絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸）殘基通過自催化反應(yīng)形成，系統(tǒng)將其命名為4-羥基亞芐基—咪唑啉酮（4-hydroxybenzlidene imidazolinone，簡稱HBI）[2]?；瘜W(xué)合成的HBI沒有熒光，這是HBI自身特性造成的：當(dāng)HBI在水溶液中，分子將主要圍繞結(jié)構(gòu)中的乙炔橋進(jìn)行類似“呼啦圈旋轉(zhuǎn)”的運(yùn)動，使得激發(fā)光能量以非輻射衰減的方式消散，宏觀表現(xiàn)為受激發(fā)時(shí)不會發(fā)出熒光。而當(dāng)HBI固定時(shí)（正確折疊的GFP中HBI被蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)固定），分子內(nèi)運(yùn)動被阻止，導(dǎo)致其無法通過分子運(yùn)動而只能以輻射的方式耗散能量，宏觀表現(xiàn)為受激發(fā)時(shí)發(fā)出熒光。

熒光蛋白可以說是大自然贈予人類的禮物，它的出現(xiàn)將“死物學(xué)”變成了真正的“生物學(xué)”。它發(fā)出的熒光猶如明燈，照亮生命體在細(xì)胞、分子層面的諸多黑暗角落，正如錢永健教授所言，熒光蛋白將生命活動這部晦澀的小說改編成了一部生動的電影。

自然界中存在天然的熒光蛋白，但尚未發(fā)現(xiàn)天然的熒光RNA。所以在RNA早期研究中，科研人員另辟蹊徑，開發(fā)出一系列基于熒光蛋白的RNA示蹤工具，即RNA結(jié)合蛋白—熒光蛋白系統(tǒng)（RNA binding protein-fluorescent protein， RBP-FP）。其中，基于噬菌體得到的MCP-FP系統(tǒng)最早被開發(fā)出來且應(yīng)用最為廣泛。該系統(tǒng)來源于噬菌體，MS2蛋白是一種噬菌體衣殼蛋白，它也是一種天然存在的RNA結(jié)合蛋白，可以特異性識別一段由19個(gè)堿基形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA，即MS2結(jié)合位點(diǎn)，并與之相互作用。在使用時(shí)，通常在靶標(biāo)基因上融合一組MS2結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)將MS2衣殼蛋白與熒光蛋白融合，將兩者在同一個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)。由于MS2結(jié)合位點(diǎn)與MS2蛋白具有較高的親和力，與靶標(biāo)RNA融合的MS2結(jié)合位點(diǎn)會拉近融合有熒光蛋白的MS2衣殼蛋白，從而使靶標(biāo)基因被“照亮”，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)RNA定位和動態(tài)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測。在這之后，科研人員不斷豐富與優(yōu)化，相繼開發(fā)了Cys4、PP7、λN22、Cas等諸多基于RNA結(jié)合蛋白的RNA成像系統(tǒng)[3]。

上述方法其實(shí)都還在借助編碼熒光蛋白的這一報(bào)告基因，但熒光蛋白自身存在的劣勢，如熒光團(tuán)成熟需要時(shí)間且需要氧氣參與，以及系統(tǒng)不可避免的游離熒光蛋白造成的背景信號，都會對示蹤效果產(chǎn)生不利的影響。尚未發(fā)現(xiàn)天然存在的熒光RNA，那我們是否可以根據(jù)熒光蛋白發(fā)光原理人工“制造”熒光RNA，從而實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)RNA的直接示蹤呢？

答案是肯定的。錢永健教授除了在熒光蛋白領(lǐng)域造詣頗高，在熒光RNA領(lǐng)域也是開山鼻祖。他在2003年報(bào)道了首個(gè)在結(jié)合RNA后可以發(fā)出熒光的熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)是一種三苯甲烷染料——孔雀綠（malachite green， MG）[4]。然而，有研究報(bào)道，MG染料在熒光輻照后會產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）而對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性。雖然MG染料并不能應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的RNA成像，但這也為熒光RNA的出現(xiàn)提供了新的想法?？蒲腥藛T可以合成類似于熒光蛋白生色團(tuán)的熒光團(tuán)，再結(jié)合20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，經(jīng)體外人工篩選得到可以與熒光團(tuán)結(jié)合的RNA適配體。RNA適配體是一段RNA序列，經(jīng)A-U、C-G、G-U堿基配對形成較為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)熒光團(tuán)分子嵌入RNA適配體形成的結(jié)合口袋時(shí)，分子內(nèi)運(yùn)動被阻礙，從而實(shí)現(xiàn)人造“熒光RNA”。這個(gè)想法雖然聽起來不難，但是實(shí)際操作起來還是會面臨許多意想不到的問題。所以時(shí)隔8年后，第一個(gè)可以應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的熒光RNA才被《科學(xué)》雜志（Science）正式報(bào)道。

熒光RNA的發(fā)展歷程

2011年，來自美國康奈爾大學(xué)的一個(gè)課題組首先報(bào)道了一個(gè)名叫Spinach-DFHBI的復(fù)合物[5]。因其受激發(fā)后發(fā)出綠光，發(fā)射波長位于505 納米，因而該RNA適配體取名“Spinach”，中文譯為“菠菜”。生色團(tuán)DFHBI是在綠色熒光蛋白生色團(tuán)HBI的基礎(chǔ)上加以修飾而得到，因此它也被稱為擬熒光蛋白RNA（RNA mimics of fluorescent protein，RMFP）。Spinach雖然實(shí)現(xiàn)了在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但由于其是二聚體，在細(xì)胞內(nèi)折疊效率低且熒光弱等，應(yīng)用十分受限。

但科研人員們并沒有放棄，而是繼續(xù)對Spinach進(jìn)行優(yōu)化，于2012年報(bào)道了性質(zhì)得到明顯提升的二代菠菜，Spinach2[6]。脆性X震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征是一種神經(jīng)退行性疾病，它的發(fā)生常與“有毒RNA”CGG錯誤堿基重復(fù)序列相關(guān)，即在轉(zhuǎn)錄過程中，出現(xiàn)長度不等的CGGCGGCGGCGG重復(fù)序列，嚴(yán)重干擾正常生理功能。利用Spinach2-DFHBI復(fù)合物，科研人員可以實(shí)現(xiàn)對“有毒RNA”CGG堿基的標(biāo)記，并且觀察到藥物治療該疾病后CGG堿基重復(fù)序列消散的動力學(xué)過程。

沒有最好，只有更好，科研之路沒有絕對的頂峰。2014年，在Spinach2的基礎(chǔ)上，科研人員在大腸桿菌中表達(dá)突變文庫，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)篩選得到性質(zhì)更為出色的RNA適配體Broccoli，中文譯為“西蘭花” [7]，并進(jìn)一步得到優(yōu)化后的生色團(tuán)DFHBI-1T。由于以上擬熒光蛋白RNA的熒光團(tuán)都是在GFP生色團(tuán)基礎(chǔ)上做的化學(xué)修飾，因而它們的光譜并沒有發(fā)生明顯變化，無論是“菠菜”還是“西蘭花”，都還屬于“綠色蔬菜”。

波長紅移一直是科研人員不斷拓展的方向，更長的波長不僅穿透力更強(qiáng)，可以對深層組織內(nèi)的靶標(biāo)RNA進(jìn)行示蹤，同時(shí)可以在一定程度上避免光毒性及細(xì)胞自發(fā)熒光造成的背景噪聲。2017年，依舊是康奈爾大學(xué)的那個(gè)課題組，他們對紅色熒光蛋白DsRFP生色團(tuán)進(jìn)行修飾，得到熒光團(tuán)DFHO。同時(shí)利用SELEX技術(shù)篩選得到可以與之結(jié)合的RNA適配體，最終得到發(fā)射波長位于545 納米的黃綠色擬熒光蛋白Corn-DFHO，“Corn”中文譯為“玉米” [8]。Corn-DFHO擁有較好的光穩(wěn)定性，可用于對活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄效率的定量分析。

以上擬熒光蛋白RNA生色團(tuán)的設(shè)計(jì)思路全部來自熒光蛋白。而與此不同的是，2014年，來自加拿大西蒙弗雷澤大學(xué)的課題組利用已知能結(jié)合雙鏈核酸的噻唑橙（thiazole Orange， TO1）的優(yōu)勢，對TO1進(jìn)行生物素（biotin）修飾，并利用微流控技術(shù)相結(jié)合的SELEX技術(shù)，篩選得到了可以結(jié)合TO1-biotin的RNA 適配體，開發(fā)了基于花青素染料的熒光RNA，Mango-TO1-biotin[9]。該熒光RNA發(fā)射波長位于535 納米，發(fā)出黃綠色熒光，所以取名“Mango”，中文譯為“芒果”。近年來，他們對Mango進(jìn)行突變優(yōu)化，得到二代、三代、四代芒果（MangoⅡ、MangoⅢ、MangoⅣ），性能進(jìn)一步提升。

無論是“菠菜”“西蘭花”“玉米”還是“芒果”，RNA 適配體本身都有一個(gè)缺陷，即天生自帶G-四鏈體。而細(xì)胞中存在天然識別G-四鏈體的核酸降解酶，這些熒光RNA在細(xì)胞中表達(dá)后，會很快被細(xì)胞識別并降解，這給它們發(fā)揮靶標(biāo)RNA示蹤功能帶來了非常不利的影響。

2019年，筆者團(tuán)隊(duì)和朱麟勇教授合作開發(fā)了全新的熒光RNA，Pepper-HBC家族[10]。全新設(shè)計(jì)的熒光團(tuán)分子HBC，經(jīng)修飾后可得到HBC系列衍生物，與RNA 適配體Pepper結(jié)合后發(fā)出不同顏色的熒光（從485 納米的青色熒光、530 納米的綠色熒光、599 納米的橙色熒光，到620 納米的紅色熒光），因而該RNA適配體起名“Pepper”，中文譯為“辣椒”或“彩椒”。全新理性設(shè)計(jì)的HBC更易于被鎖定在RNA適配體中，且背景熒光低、無細(xì)胞毒性。同時(shí)Pepper本身是單體參與結(jié)合，不含有G-四鏈體，與HBC的結(jié)合力也非常強(qiáng)，可達(dá)到納摩爾級。此外，Pepper系列熒光RNA亮度高且穩(wěn)定，無論是在體外還是活細(xì)胞內(nèi)均具有出色的表現(xiàn)，這使得Pepper可實(shí)現(xiàn)對不同豐度功能性RNA的示蹤研究，同時(shí)不影響它們的空間分布和動態(tài)變化。

研究人員聯(lián)用Pepper和熒光蛋白，通過流式細(xì)胞術(shù)，同時(shí)檢測Pepper標(biāo)記的mRNA及其翻譯的融合熒光蛋白的蛋白質(zhì)水平，首次實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的活體單細(xì)胞mRNA的翻譯調(diào)控分析。利用Pepper得到的翻譯調(diào)控分析數(shù)據(jù)顯示，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人胃癌細(xì)胞MKN-45、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87、人食管癌細(xì)胞TE-1和人前列腺癌細(xì)胞PC-3等癌細(xì)胞系的R2數(shù)值（通過米氏方程擬合得出，表示相關(guān)性強(qiáng)度）均低于正常細(xì)胞系（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3和人胚腎細(xì)胞293T/17）的R2數(shù)值，這意味著在癌細(xì)胞中翻譯調(diào)控存在失衡。此外，研究者們還利用Pepper實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中RNA的動態(tài)追蹤。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)與其mRNA的含量存在著很弱的相關(guān)性，換而言之，腫瘤細(xì)胞中的翻譯過程是嚴(yán)重失調(diào)的。這為腫瘤的診療提供了一種全新的思路和方法。

聯(lián)用Pepper和CRISPR基因標(biāo)記系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對不同基因位點(diǎn)的多色且可快速切換熒光的成像標(biāo)記及分析。此外，Pepper620發(fā)射波長達(dá)到紅色波段620 納米，熒光亮度高、光穩(wěn)定性強(qiáng)，可用于結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像（structure illumination microscopy，SIM），這也是首次實(shí)現(xiàn)熒光RNA對光學(xué)衍射極限的突破，為功能性天然RNA的超分辨成像提供新的強(qiáng)有力工具。因此，這些出色的性能使Pepper-HBC成為目前可以在哺乳動物細(xì)胞中對靶標(biāo)RNA進(jìn)行示蹤的最佳熒光RNA。

熒光RNA的未來發(fā)展

熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)源于人類對自然的觀察與好奇，而熒光RNA的發(fā)展過程則表現(xiàn)出人類的理性思考，以及對生命本質(zhì)的不斷探索。從第一個(gè)可以在哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的熒光RNA算起，熒光RNA的發(fā)展還不足10年。這得益于其站在巨人的肩膀上，趕在生命科學(xué)蓬勃發(fā)展的黃金時(shí)代。Pepper作為目前表現(xiàn)效果最好的熒光RNA，除可用于活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)RNA的示蹤，進(jìn)行基礎(chǔ)的科學(xué)研究外，未來還可用于發(fā)展任意標(biāo)靶的檢測探針，為活細(xì)胞與活體生物傳感、即時(shí)診斷，甚至實(shí)時(shí)診斷技術(shù)的發(fā)展提供新的機(jī)遇。

實(shí)際上熒光RNA的發(fā)展仍處在起步階段，未來的熒光RNA需朝著遠(yuǎn)紅、甚至近紅外波段發(fā)展，提高亮度與穩(wěn)定性，以實(shí)現(xiàn)單分子、超分辨成像，實(shí)現(xiàn)活體動物的靶標(biāo)RNA實(shí)時(shí)監(jiān)測，直至最終應(yīng)用于臨床。熒光RNA歸根結(jié)底是一門生物技術(shù)，一個(gè)工具，如何用好這個(gè)工具推動生物學(xué)向前發(fā)展，解決人類在疾病診療中遇到的問題，真正造福于全人類，這需要各領(lǐng)域科研人員的共同努力。本文介紹的都是十分經(jīng)典且成功的熒光RNA代表，其實(shí)還有數(shù)以億計(jì)的候選熒光RNA被淘汰和淹沒?？茖W(xué)之路從來都不會一帆風(fēng)順，也許真正值得銘記的是那些已被遺忘的無數(shù)次的失敗與嘗試，真正偉大的是那些在黑暗中仍舊不斷求索的人。

[本文得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFA050400、2019YFA0904800），國家自然科學(xué)基金（91857202、21937004、31971349、31600688）和上海市科學(xué)技術(shù)基金（18JC1411900）的資助。]

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關(guān)鍵詞：熒光RNA 熒光蛋白 活細(xì)胞成像 ■