GnIH/RFRP-3通過受體GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導雌激素受體陽性人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的研究

王鳳霞，魏 萌，司麗娜，楊松鶴，程露陽，喬躍兵，馬秀艷

(1.承德醫(yī)學院,河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

乳腺癌是女性最常診斷出的癌癥，在女性癌癥相關(guān)死亡原因中位居第二[1]。在乳腺癌的分子分型中，以雌激素受體陽性(hormone receptor positive，HR+)者居多，約占 70%[2]。目前以手術(shù)切除和化療輔助為主要治療方式，但手術(shù)切除和化療輔助治療均會給患者產(chǎn)生嚴重的生理和心理創(chuàng)傷，尋求不同治療方式和藥物抑制乳腺癌腫瘤細胞的增殖及活力尤為重要[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌治療手段可通過降低或競爭性抑制腫瘤生長依賴的激素(主要為雌激素)或其受體，抑制腫瘤細胞增殖[4]。雖然內(nèi)分泌治療副作用較小，但會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，所以尋求新的藥物尤為重要。因此，本文旨在研究一種由下丘腦分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌肽-促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)，通過與受體GPR147結(jié)合經(jīng)下丘腦-垂體-性腺軸抑制促黃體生成素(luteinizing hormone ，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的分泌和釋放，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)。所以，本研究應(yīng)用GnIH來探討其是否對雌激素受體陽性乳腺癌的凋亡造成影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng):人乳腺癌細胞系MCF-7在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%按1∶2～3進行傳代，取細胞對數(shù)生長期進行相關(guān)實驗。

1.2藥物及其配置:RPRF-3規(guī)格1g，購于Tocris Bioscience，U.K。將1g藥物溶于0.5mL PBS中配成2mg/mL的母液，每15μL分裝于EP管-20℃避光保存。15μL藥物溶液溶于培養(yǎng)基用0.22μm的無菌過濾器過濾，獲得10000ng/mL的GnIH藥物溶液，倍比稀釋配置成0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的GnIH藥物溶液。RF9規(guī)格1mg，購于MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。將1mg抑制劑溶于0.2072mL DMSO中配成10mM的母液，每8μL分裝于EP管-20℃避光保存。

1.3試劑:DMEM/RPML1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco)，Biological Industries(BI)公司特級胎牛血清(中美血源)，cell counting kit-8(CCK-8)購于美國APExBIO，青霉素和鏈霉素、PBS、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自索萊寶公司，ECL 發(fā)光液購自大連美侖公司，兔單克隆抗體(Gapdh、Bcl-2、Bax、caspase-3、cytochrome C、Hsp90、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR)購于Abcam公司，GPR147兔單克隆抗體購于Bioss公司，羊抗兔二抗購于Abclone公司。

1.4儀器:高速冷凍離心機購自北京大龍公司，化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能公司，酶標儀購自BioTEK公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，熒光定量PCR儀購于BIORAD公司(美國)，雙控溫干式恒溫孵育器購自杭州米歐儀器。

1.5CCK-8檢測細胞增值率:收集對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以8×103個細胞/孔接種于96孔板中，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24h，吸棄培養(yǎng)基，實驗組分別加入含GnIH濃度為(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL)的培養(yǎng)基，設(shè)調(diào)零組和PBS對照組，每組設(shè)4個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24后取出，每孔加入100μLCCK-8試劑，于37℃恒溫箱中避光孵育2h，酶標儀測定450nm處的吸光度(OD)值，根據(jù)公式計算細胞抑制率。細胞增殖抑制率=(PBS對照組OD值-GnIH實驗組OD值)/(PBS對照組OD值-調(diào)零組OD值)。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡:取細胞對數(shù)生長期，胰酶消化重懸繼續(xù)培養(yǎng)24h加藥，PBS對照組、GnIH實驗組10000ng/mL培養(yǎng)24h。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)1×105，PBS洗兩遍(1000r/min，5min)，棄上清液，加入1×Bidding Buffer懸浮，轉(zhuǎn)移至流式管中，分別加入5μLAnnexin V-FITC和5 μL PI，輕輕渦旋細胞，室溫25℃暗室孵育15min，每個流式管加入400μL 1×Bidding Buffer，1h內(nèi)完成上機檢測。

1.7實時熒光定量PCR檢測相關(guān)mRNA表達水平:使用Takare試劑盒提取MCF-7細胞各組總RNA，分光光度計測定RNA濃度及純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，每組設(shè)3個復孔，經(jīng)PCR儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測RNA表達水平，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量，本實驗以GAPDH為內(nèi)參。

1.8蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白表達水平:應(yīng)用Western Blot法對相關(guān)蛋白表達情況進行檢測。取MCF-7對數(shù)生長期細胞懸液，按GnIH給藥濃度(0ng/mL、10000ng/mL)接種于底面積為21cm3的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出各組細胞培養(yǎng)皿，吸棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS清洗，加適當體積的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱過夜，冰上裂解30min，收集細胞懸液，置于4℃低溫高速離心機中以12000r/mim離心15min，取上清。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer與上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10mim，使蛋白變性，冷卻至室溫-20℃保存。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本(20μg)，分離后電流設(shè)定200mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，取相應(yīng)特異性一抗孵育2h(Bcl2 1∶800、Bax 1∶800、Caspase-3 1∶5000、cytochrome C 1∶5000、Hsp90 1∶10000、Gapdh 1∶10000、P531∶1000、PI3K1∶500、AKT1∶10000、p-AKT1∶1000、m-TOR1∶1000和GPR1471∶1000)均為兔單克隆抗體，4℃過夜，復溫30min，TBST洗膜緩沖液洗3次，加入HRP熒光標記的二抗(1∶8000)，室溫孵育1h，洗膜后加入ECL特超敏試劑，經(jīng)Tanon 6100凝膠成像儀掃描顯影。采用 Image J 軟件分析，通過比較目標蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來確定目標蛋白的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1GnIH對MCF-7細胞增殖的影響:與PBS對照組相比，經(jīng)GnIH(10000ng/mL)處理MCF-7細胞24h后，CCK-8檢測OD值明顯降低(P<0.05)，對MCF-7細胞增殖抑制率為9.272%。見表1。

表1 GnIH對MCF-7細胞增殖的影響

2.2GnIH誘導MCF-7細胞凋亡的流式檢測結(jié)果:經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果如圖1，GnIH分別按空白對照組和10000ng/mL藥物濃度加入到MCF-7作用24h后，其空白對照組和10000ng/mL組的凋亡率分別為(7.76±1.57)%和(16.14±3.001)%。各組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=6.164，P=0.0351)。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測MCF-7細胞凋亡情況

2.3GnIH在mRNA水平上對凋亡相關(guān)基因的影響:在MCF-7中對照組和10000ng/mL實驗組之間BaxmRNA表達水平上調(diào)(F=6.495，P<0.05)、Caspase-3mRNA表達水平上調(diào)(F=22.61，P<0.01)和TP53mRNA表達水平顯著上調(diào)(F=10.31，P<0.05)。同樣Bcl-2mRNA和Hsp90mRNA組間比較，Bcl-2mRNA的表達水平在10000ng/mL時顯著下降(F=18.26，P<0.01)，Hsp90mRNA的表達水平與Bcl-2一致(F=12.1，P<0.01)。與對照組相比，PI3KmRNA與AKTmRNA的表達水平顯著下降(F=3.993，P<0.05；F=3.776，P<0.05)，見表2。

表2 相關(guān)基因mRNA的表達水平

2.4凋亡相關(guān)蛋白的表達水平:與對照組相比較，GnIH10000ng/mL實驗組Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)、P53(P<0.05)蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2(P<0.01)蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

(A 凋亡相關(guān)蛋白的印跡圖。B 凋亡相關(guān)蛋白的相對表達量)

2.5PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達：Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)10000ng/mL的GnIH作用MCF-7細胞24h后，與對照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對表達量依次降低；在10000ng/mL時與對照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達

2.6MCF-7細胞系GRP147受體表達情況：對照組與GnIH實驗組10000ng/mL相比較，MCF-7細胞系上的GPR147蛋白表達在10000ng/mL是表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 MCF-7細胞系GRP147受體表達情況

2.7拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH對相關(guān)蛋白的影響：抑制劑干預(yù)后，實驗組GnIH10000ng/mL與對照組相比AKT/p-AKT蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，GnIH10000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實驗組與實驗組GnIH10000ng/mL比較，MCF-7細胞AKT/p-AKT蛋白表達量顯著增高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH/RFRP-3對相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

乳腺癌屬于激素依賴性腫瘤,雌激素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在占比較高的HR+ 乳腺癌中，對抗雌激素的內(nèi)分泌治療效果是顯著的[5]。研究表明，GnIH通過下丘腦-垂體-性腺軸抑制促卵泡激素FSH、黃體生成素LH釋放，抑制卵泡顆粒層細胞增生分化，抑制卵巢發(fā)育，降低雌激素合成與分泌。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)對細胞凋亡有影響，但作用機制尚不明確。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是一類七次跨膜的蛋白家族，與神經(jīng)遞質(zhì),激素等配體結(jié)合激活GPCR，使各種細胞外信號轉(zhuǎn)入細胞內(nèi),從而在調(diào)節(jié)細胞功能中起重要作用,這也和人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。本研究使用的GnIH其受體為G蛋白偶聯(lián)受體147(G protein-coupled receptor147，GPR147)是GPCR家族成員，當GnIH與其膜受體GPR147結(jié)合后，將GnIH從細胞外輸送到胞體內(nèi)，引起細胞生長狀態(tài)的改變。本實驗結(jié)果顯示，人乳腺癌細胞系MCF-7膜上存在GPR147受體，并且隨著GnIH藥物濃度的升高，促進了GPR147受體的表達，造成MCF-7細胞的凋亡率增加。此外，激活的GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路。PI3K/AKT/mTOR信號通路參與了細胞的生長、增殖、凋亡等多種生物學過程，并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。PI3K通過激活絲氨酸/蘇氨酸酶AKT，AKT又通過大量的調(diào)節(jié)子最終造成絲氨酸/蘇氨酸酶MTOR的磷酸化。在腫瘤細胞中PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑常處于被激活狀態(tài),從而維持其活躍的增殖能力。但是，本研究結(jié)果顯示GnIH在10000ng/mL時與對照組相比抑制了MCF-7細胞的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表達水平，表明當GnIH達到10000ng/mL時較明顯抑制了PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而抑制MCF-7的增殖。GPR147特異性拮抗劑RF9，可以抑制其受體活性，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)[8,9]。本實驗GnIH聯(lián)合RF9作用MCF-7細胞系，結(jié)果顯示抑制劑干預(yù)后，實驗組GnIH1000ng/mL與對照組相比AKT/p-AKT蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，GnIH1000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實驗組與實驗組GnIH1000ng/mL比較，MCF-7細胞AKT/p-AKT蛋白表達量顯著增高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果提示，GnIH可能通過影響GPR147的活性發(fā)揮抑制MCF-7細胞增殖的效應(yīng)。

細胞凋亡是細胞受特定基因調(diào)控的主動性的有序死亡，主要由內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)揮作用[10]。線粒體作為細胞凋亡的控制中心，當細胞受到外界藥物刺激時會損傷線粒體功能，引起B(yǎng)cl-2家族中Bcl-2/Bax這兩種蛋白相對表達量的變化[11]。p53是與癌癥相關(guān)的最常見突變基因,在多種應(yīng)激誘發(fā)的凋亡中起關(guān)鍵作用，當細胞接受到凋亡信號后p53蛋白行使轉(zhuǎn)錄因子的作用上調(diào)Bax/Bcl-2比值，線粒體膜電位變化并最終提高線粒體外膜通透性，同時會將細胞色素C(cytochrome C，Cyto C)釋放至細胞質(zhì)，進一步激活caspase-3增強細胞凋亡。在本實驗中可以看出，與對照組比較，GnIH1000ng/mL實驗組P53、Bcl-2、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達水平無顯著變化，GnIH10000ng/mL實驗組P53、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達水平顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達量顯著下調(diào)。說明低劑量的GnIH對MCF-7細胞凋亡作用較小，而藥物劑量達到10000ng/mL時細胞凋亡率較顯著。

熱休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程中起重要作用的分子伴侶蛋白家族[12]。其中[13]，HSP90是熱休克蛋白家族中最活躍的分子伴侶之一，PI3K和AKT都是HSP90重要伴侶蛋白。HSP90在多數(shù)腫瘤中高表達，參與腫瘤的增殖、遷移和侵襲。結(jié)合Western Blot和qRT-PCR實驗結(jié)果，促性腺激素抑制激素對雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細胞HSP90蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)GnIH可以抑制HSP90的表達，提示GnIH通過抑制HSP90的表達進而促進MCF-7的凋亡，推測GnIH作用腫瘤細胞可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

總之，GnIH可以抑制雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細胞的增殖。其作用機制可能通過GPR147受體抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路和激活線粒體凋亡途徑引起凋亡因子Bax和caspase凋亡家族上調(diào)有關(guān)。另外，由于GnIH抑制熱休克蛋白HSP90的表達可推測，通過抑制腫瘤細胞的應(yīng)激反應(yīng)進而促進凋亡。然而，本研究僅為體外實驗未涉及到體內(nèi)實驗，并且對具體機制及其信號通路尚有欠缺，亟待后續(xù)進一步深入研究。