XAGE1A與PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特點(diǎn)及相關(guān)性研究

孫晨 汪碩敏 夏云紅

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為死亡率最高的病理分型，是威脅人們身心健康的重要腫瘤類(lèi)公共健康問(wèn)題[1]。隨著醫(yī)療水平的提高，以程序性死亡受體/配體1 (programmed death 1/ligand 1, PD-1/L1)[2-4]等為靶點(diǎn)的綜合治療方式一定程度上提高了NSCLC患者的生存質(zhì)量和時(shí)間，但多數(shù)患者預(yù)后仍然較差[5]。X抗原家族成員1A(X antigen family member 1a, XAGE1A)是癌癥/睪丸(Cancer/testis, CT)抗原家族的成員[6-8]，其介導(dǎo)的免疫保護(hù)作用有利于免疫療法的實(shí)施[9-10]。伴隨免疫治療的快速發(fā)展，作用于PD-1/PD-L1的免疫檢查點(diǎn)抑制劑成為晚期NSCLC的有效治療方法[11-12]，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于XAGE1A與PD-L1在NSCLC患者中的表達(dá)特征及相關(guān)性研究尚未有報(bào)道，因此探討XAGE1A與PD-L1的關(guān)系，尋找NSCLC診療的潛在分子標(biāo)志物具有重要意義。

資料與方法

一、樣本來(lái)源

選擇安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科2017年01月至2020年01月的NSCLC患者75例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入研究的患者經(jīng)病理切片診斷均證實(shí)為NSCLC；②患者為初診病例，術(shù)前均未接受放化療、靶向治療或免疫治療等其它治療；③患者一般資料完整，且入組前均已簽署知情同意書(shū)；④患者在手術(shù)治療后均可配合門(mén)診或電話(huà)隨訪。根據(jù)患者入院早晚隨訪時(shí)間為5～36月不等，中位隨訪時(shí)間為24個(gè)月。患者臨床資料如下：患者年齡57.31±6.45歲；女性35例(46.67%)，男性40例(53.33%)；脈管侵犯56例(74.67%)，無(wú)脈管侵犯19例(25.33%)；低分化21例(28%)，中高分化54例(72%)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期52例(69.33%)，Ⅲ～Ⅳ期23例(30.67%)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例(20%)；腫瘤直徑以5 cm為界，大于5 cm共40例(53.33%)，小于5 cm 共35例(46.67%)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者8例(10.37%)，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者67例(89.33%)；選取75例NSCLC患者病理標(biāo)本中，取距腫瘤組織≥5 cm的非腫瘤組織作為癌旁組織，癌旁組織經(jīng)病理組織學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。

二、主要試劑

DAB顯色試劑盒(36303ES01)和免疫組化試劑盒(36312ES75)均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，兔抗人XAGE1A多克隆抗體(PRO-1256)購(gòu)自艾美捷科技公司，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和熒光定量PCR試劑盒(RR820A)均購(gòu)自大連TAKARA公司，RNA裂解液(TRIzol)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司等。

三、RT-qPCR

取50～100 mg組織樣本加RNA裂解液1 mL，搖勻消化3～5 min后加入氯仿約200 μL在4℃ 12000 g離心15 min。上清液混入0.5 mL異丙醇， 4℃ 12000 g離心10 min，無(wú)酶水溶解后測(cè)RNA濃度。根據(jù)Takara試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系的配置，去除基因組DNA反應(yīng)為42℃、2 min，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為37℃、15 min轉(zhuǎn)85℃、5 s。反轉(zhuǎn)錄樣本行qPCR反應(yīng)體系配置，按預(yù)變性95℃、30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，條件設(shè)置為95℃、5 s轉(zhuǎn) 60℃、30 s。XAGE1A forward primer, 5′-CCCAGGAGCCCAGTAATGGAGAG-3′; XAGE1A reverse primer, 5′-TCTGTCTGCTGCCC AGGTGTAG-3′; PD-L1 forward primer, 5′-GCTGCAC TAATTGTCTATTGGG-3′; PD-L1 reverse primer, 5′-CA CAGTAATTCGCTTGTAGTCG-3′; GAPDH forward primer, 5′-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′; GAPDH reverse primer, 5′-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3′。

四、免疫組織化學(xué)染色

取75例NSCLC患者手術(shù)切除樣本，經(jīng)包埋后制成石蠟塊，并用切片機(jī)切成4 μm厚的薄片。采用免疫組化(SP法)測(cè)定NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及淋巴結(jié)(距離腫瘤組織5 cm以上)標(biāo)本中XAGE1A蛋白表達(dá)。簡(jiǎn)要操作如下：切片二甲苯-梯度酒精脫蠟至水，洗凈和抗原修復(fù)后，加入雙氧水阻斷過(guò)氧化物酶，封閉15 min，再用Ultra V Block封閉背景，洗凈后加入XAGE1A抗體(1 ∶100 稀釋)孵育過(guò)夜，繼以一抗增強(qiáng)劑和二抗孵育，DAB顯色。顯微鏡下見(jiàn)黃褐色斑時(shí)加入ddH2O充分沖洗停止顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，烘干后鏡下觀察。

五、結(jié)果判斷

按照既往報(bào)道，XAGE1A為癌癥/睪丸抗原家族成員，故將胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色染色顆粒的細(xì)胞視為陽(yáng)性。XAGE1A蛋白表達(dá)水平定性分析根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積的乘積計(jì)算。染色面積：陽(yáng)性范圍≤10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，50%～80%計(jì)3分，80%以上計(jì)4分。染色強(qiáng)度：無(wú)陽(yáng)性染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。上述免疫組化評(píng)分，由2名病理科醫(yī)師采取雙盲方式進(jìn)行，并綜合結(jié)果進(jìn)行評(píng)判。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析。RT-qPCR中腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A或PD-L1相對(duì)表達(dá)量輸入SPSS 25.0軟件數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)量資料表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，均為雙側(cè)檢測(cè)，數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)分析；XAGE1A與臨床病理特點(diǎn)關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 法并經(jīng)Log-Rank 檢驗(yàn)，腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A與PD-L1免疫組化評(píng)分使用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；XAGE1A與PD-L1表達(dá)量關(guān)系使用pearson相關(guān)性分析。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、XAGE1A mRNA在NSCLC腫瘤(tumor)組織和癌旁(para-tumor)組織中的表達(dá)

獲取75例NSCLC患者腫瘤與癌旁組織檢測(cè)XAGE1A表達(dá)水平并進(jìn)行配對(duì)比較，RT-qPCR結(jié)果顯示，XAGE1A mRNA在NSCLC組織中平均表達(dá)水平高于癌旁組織(見(jiàn)圖1a)。

二、XAGE1A 與PD-L1 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)關(guān)系

對(duì)75例NSCLC患者的腫瘤組織進(jìn)行XAGE1A 與PD-L1 mRNA檢測(cè)，RT-qPCR結(jié)果顯示，XAGE1A 與PD-L1mRNA表達(dá)水平存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.2647(見(jiàn)圖1b)。

圖1 XAGE1A和PD-L1在NSCLC不同類(lèi)別組織中的mRNA表達(dá)及相關(guān)性。a： 分別為XAGE1A和PD-L1在癌旁組織與腫瘤組織中的mRNA表達(dá)；b： 為75例患者腫瘤組織中XAGE1A和PD-L1表達(dá)相關(guān)性。注：**P<0.01

三、NSCLC腫瘤及其癌旁組織中XAGE1A和PDL1蛋白表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，XAGE1A 蛋白在腫瘤組織、癌旁組織中均定位于細(xì)胞核，陰性表達(dá)不著色，陽(yáng)性表達(dá)呈淡黃、棕黃至棕褐色(見(jiàn)圖2a、b)；此外，XAGE1A蛋白在PD-L1(-)組織中細(xì)胞核基本不著色，多為低表達(dá)，PD-L1(+～)組織中細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃至棕褐色顆粒，表達(dá)為陽(yáng)性(見(jiàn)圖2c、d)。NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽(yáng)性數(shù)為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)(P<0.001)；XAGE1A 蛋白在PD-L1陰性表達(dá)的NSCLC腫瘤組織中總陽(yáng)性數(shù)為18例(66.7%)，低于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)(P<0.001)(見(jiàn)表1,2)。

表1 XAGE1A在NSCLC不同類(lèi)型組織中的蛋白表達(dá)

表2 XAGE1A與PD-L1在配對(duì)腫瘤組織中的蛋白表達(dá)

圖2 XAGE1A在NSCLC不同類(lèi)別組織中的蛋白表達(dá) a為癌旁組織，XAGE1A無(wú)明顯表達(dá)，b為NSCLC腫瘤組織，XAGE1A在結(jié)腸癌細(xì)胞胞核中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，c為PD-L1(-)的腫瘤組織，XAGE1A無(wú)明顯表達(dá)，d為PD-L1(+)的腫瘤組織，XAGE1A在部分腺體腫瘤細(xì)胞胞核中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(放大倍數(shù)均為400×)。

四、XAGE1A 蛋白與NSCLC臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

XAGE1A蛋白表達(dá)與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者XAGE1A蛋白陽(yáng)性率高于所對(duì)應(yīng)項(xiàng)目的非上述分類(lèi)陽(yáng)性率(P<0.05)；而XAGE1A蛋白表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理類(lèi)型無(wú)關(guān)(P>0.05)。PD-L1蛋白表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系與XAGE1A蛋白表達(dá)情況相同，也與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 XAGE1A蛋白與NSCLC臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

五、NSCLC組織中XAGE1A 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

納入研究的75名NSCLC患者的3年總生存率為21.78%(95%CI: 2.12～4.25%)，XAGE1A 陽(yáng)性表達(dá)患者的3年生存率為26.35%(95%CI: 2.11～4.09%)，XAGE1A陰性表達(dá)患者的3年生存率為8.27%(95%CI: 2.44～4.87%)，XAGE1A 陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間低于XAGE1A 陽(yáng)性表達(dá)患者(P=0.0264)。隨訪3年中，兩組患者的生存曲線(見(jiàn)圖3)，XAGE1A 陽(yáng)性患者生存率明顯高于陰性患者，且XAGE1A 陽(yáng)性表達(dá)患者生存期明顯長(zhǎng)于陰性表達(dá)者，表明XAGE1A的表達(dá)水平可作為NSCLC患者的重要預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)(見(jiàn)圖3)。

圖3 XAGE1A陽(yáng)性(High)和陰性(Low)表達(dá)患者的生存曲線

討 論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌是肺癌主要類(lèi)型，其包括多種組織學(xué)亞型，包括腺癌、支氣管肺泡癌、鱗癌、間變性和大細(xì)胞癌[13]。盡管過(guò)去幾十年來(lái)在肺癌治療方面取得了技術(shù)上的進(jìn)步，但診斷后的五年總生存率仍為20%。以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療是近二十年來(lái)肺癌領(lǐng)域發(fā)展最快的治療方法之一，其有效延長(zhǎng)了患者OS，但不適用于少數(shù)PD-L1低表達(dá)、耐藥患者，因此探索免疫治療合適的協(xié)同診療靶標(biāo)是提高免疫治療療效的重要問(wèn)題。XAGE1A作為癌癥/睪丸抗原(CTAs)基因家族成員，在多種腫瘤中存在表達(dá)，例如尤因氏肉瘤、黑素細(xì)胞瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺泡橫紋肌肉瘤和某些上皮腫瘤中[9, 11, 14-15]。XAGE1A位于X染色體上，其在某些癌癥患者中還觀察到了針對(duì)XAGE1A的血清反應(yīng)性[16]，這表明XAGE1具有免疫原性。XAGE1高表達(dá)誘導(dǎo)的CD4和CD8 T細(xì)胞反應(yīng)，促使患者產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[17]，故有學(xué)者指出XAGE1有望作為靶向免疫治療的潛在標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)用于NSCLC和前列腺癌的治療當(dāng)中。目前關(guān)于XAGE1相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外多集中在轉(zhuǎn)錄本XAGE1B上，周清等[18]發(fā)現(xiàn)30例肺癌組織中，XAGE1B基因表達(dá)陽(yáng)性率為40%(12/30)，而30例癌旁正常肺組織不表達(dá)該基因；腺癌中基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于其他病理類(lèi)型(61.1%vs 8.3%,P=0.015)，可優(yōu)先選擇該基因作為肺腺癌免疫治療靶點(diǎn)。周清等[19]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中VEGFR-2與XAGE1B基因表達(dá)呈正相關(guān)，XAGE1B表達(dá)陽(yáng)性并且VEGFR-2高表達(dá)的患者可能是免疫療法與抗血管生成療法聯(lián)合治療的合適人群。但國(guó)內(nèi)關(guān)于XAGE1A在NSCLC患者樣本中表達(dá)水平及其與PD-L1表達(dá)關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

本文通過(guò)對(duì)院內(nèi)2017年到2020年75例NSCLC患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織相較癌旁組織中XAGE1A與PD-L1 mRNA與蛋白表達(dá)率均升高，且二者表達(dá)存在正相關(guān)性。XAGE1A和XAGE1D蛋白分別由81和69個(gè)氨基酸組成，它們共有相同的氨基酸末端，最高至32個(gè)氨基酸。一些報(bào)道表明[20]，來(lái)自肺癌患者的血清與XAGE1A反應(yīng)，提示XAGE1即含有核定位信號(hào)，也存在于細(xì)胞外空間。本研究經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法，發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽(yáng)性數(shù)為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)；XAGE1A 蛋白在PDL1陰性表達(dá)的NSCLC腫瘤組織中總陽(yáng)性數(shù)為18例(66.7%)，低于PDL1陽(yáng)性表達(dá)的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)。通過(guò)病理特征分析，發(fā)現(xiàn)XAGE1A與PD-L1蛋白在TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中陽(yáng)性表達(dá)率更高，但與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理類(lèi)型無(wú)顯著關(guān)系。已有研究證明，XAGE1可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的加工和呈遞過(guò)程，增加MHC-I分子的產(chǎn)生水平，從而直接激活腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答[21]；通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)XAGE1基因的小鼠腫瘤模型，Xie等[22]發(fā)現(xiàn)IFN-γ分泌增加、IL-6分泌減少，樹(shù)突狀細(xì)胞增加且特異性T細(xì)胞免疫活性增強(qiáng)，上述表現(xiàn)可能是NSCLC中XAGE1A高表達(dá)促進(jìn)患者自身免疫激活的原因之一。進(jìn)一步生存分析結(jié)果則提示XAGE1A 在NSCLC腫瘤組織陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間高于XAGE1A 陰性表達(dá)患者。鑒于XAGE1A與PD-L1存在顯著相關(guān)性，本研究結(jié)果有利于指導(dǎo)XAGE1A作為PD-L1治療的判斷標(biāo)準(zhǔn)和協(xié)同治療的靶標(biāo)之一，有望用于NSCLC治療。

綜上所述， XAGE1A與PD-L1在NSCLC腫瘤組織表達(dá)均升高，但與NSCLC病理類(lèi)型無(wú)顯著關(guān)系，XAGE1A陽(yáng)性率與PD-L1陽(yáng)性率呈正相關(guān)。XAGE1A 呈高表達(dá)患者的生存時(shí)間越長(zhǎng)，提示XAGE1A 對(duì)NSCLC可能存在保護(hù)作用，有望成為NSCLC的免疫治療潛在分子靶點(diǎn)。