薯蕷皂苷對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的保護作用研究

尹連紅 許麗娜 彭金詠

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary fibrosis, IPF)是一種呈進展性和致死性的彌漫性肺間質(zhì)疾病，早期以肺泡炎癥為特征，后期發(fā)展至大量成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)大量沉積[1-2]。博萊霉素(Bleomycin, BLM)是一種廣譜抗腫瘤藥物，在使用后期會導(dǎo)致肺纖維化癥狀，被廣泛用于肺纖維化模型的相關(guān)研究。薯蕷皂苷(Dioscin, Dio, 圖1)廣泛存在于薯蕷科、石竹科、薔薇科和百合科等植物中，屬于三萜皂苷類化合物。薯蕷皂苷具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗感染、降血脂及肝保護作用等[3]，其通過抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用保護急性肝損傷及肝纖維化[4-6]。本研究在BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中探討薯蕷皂苷對肺纖維化的影響，并對其作用機制進行初步探討，為肺纖維化的治療提供新的契機。

圖1 薯蕷皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式

資料與方法

一、動物與材料

雄性SD大鼠，體重180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(遼)2015-0006，室溫22 ± 2℃，濕度55%-70%，自由攝食與飲水。

薯蕷皂苷為本實驗室制備，純度≥98%(與標(biāo)準(zhǔn)品對照)，結(jié)構(gòu)經(jīng)UV、MS和NMR鑒定[7](圖1)；強的松購自Sigma Chemical Co；蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒，均購自南京建成生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測定和BeyoECL Plus試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；甘氨酸、Tris、SDS等購自美國Sigma Chemical Co.；一抗兔源Foxo3a、ICAM-1、P65、TGF-β1、GAPDH、兔源二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

二、實驗動物分組處理

72只成年雄性SD大鼠(200～220 g)隨機分為6組：生理鹽水對照組(Control)，BLM組(Model)，薯蕷皂苷給藥組(Dio 15、30和60 mg/kg)，強的松陽性對照組(PND 50 mg/kg)。BLM組經(jīng)氣管單次給予BLM (3 mg/kg)，薯蕷皂苷給藥組和強的松陽性對照組：在BLM處理前7天及處理后30天每24 h灌胃給藥一次，對照組給予等量生理鹽水。用蘇木精-伊紅(H&E)染色，Masson染色，天狼猩紅(Sirius Red)染色檢測肺病理改變。各組動物分別于BLM處理后30天停止給藥。于末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，眼后靜脈叢取全血經(jīng)離心得血清。處死大鼠，取出肺組織，測定肺系數(shù)，部分肺組織置于10%甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)研究。

三、肺系數(shù)及生化指標(biāo)檢測

肺系數(shù)是肺纖維化的一項測量指標(biāo)，稱定大鼠體重和肺濕重，計算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺濕重(g)/體重(kg) × 100%。

根據(jù)說明書測定血清的總抗氧能力T-AOC，用于評價肺組織損傷程度。

四、肺組織羥脯氨酸(HPY)含量測定

將肺組織勻漿離心后取上清，按HYP試劑盒中的酸水解法說明書，測定每組大鼠肺組織中HYP的含量。

五、Western blot

取肺組織按照試劑盒說明書進行操作，加入裂解液，充分勻漿，然后10000 rpm，4℃離心10 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。組織蛋白與2 × loading buffer (100 μL + 4 μL β-巰基乙醇)按1: 1 (v/v)混勻，煮沸5 min，-80℃分裝保存?zhèn)溆?。根?jù)目標(biāo)蛋白分子量配制適當(dāng)比例的SDS-PAGE進行電泳；根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；將載有目標(biāo)蛋白的PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，搖床上室溫封閉3 h。將封閉好的膜用TTBS洗5 min，放入相應(yīng)比例的一抗中，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次10 min，放入對應(yīng)的二抗中，搖床上室溫孵育2 h，TTBS洗膜三次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光顯影，并采用Lab Works 4.6專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠肺系數(shù)、T-AOC和HYP的含量

肺系數(shù)是反映肺纖維化程度的一個重要指標(biāo)，如由(圖2A)所示，與Control相比，Model組的肺系數(shù)明顯升高，由3.99±0.63上升至5.83±1.16 (P=0.005)；與Model組比較，薯蕷皂苷給藥組(Dio 60 mg/kg，Dio 30 mg/kg)大鼠肺系數(shù)明顯降低，Dio 60 mg/kg組可降低至3.59±0.40，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如由(圖2B)所示，與Control相比，Model組的總抗氧能力顯著升高，由3.23±0.69上升至43.44±12.42 (P=0.0023)；與Model組相比，薯蕷皂苷給藥組顯著降低(P<0.01)，Dio 60 mg/kg組可降低至6.02±0.59。如(圖2C)所示，與Control相比，Model組的HYP的表達量明顯增加(P<0.05)；與Model組相比，14天時薯蕷皂苷給藥組中大鼠肺組織HYP的含量無顯著變化，28天時薯蕷皂苷給藥組大鼠肺組織HYP的含量明顯減少(P<0.05)，且Dio 30 mg/kg組的治療效果與PDN 50 mg/kg組相當(dāng)。

二、肺組織病理結(jié)果

正常大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁正常，偶見炎癥細胞，無間質(zhì)纖維化增生；BLM造模7天結(jié)果表明大鼠肺組織病變早期表現(xiàn)為滲出性肺泡炎，炎癥細胞在病變處聚集增多。BLM造模14天時，與Control組相比，BLM組HYP含量明顯升高，由0.57±0.14上升至0.83±0.25(圖2C)。顯微鏡下可見廣泛炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、單核吞噬細胞為主，并有肺泡壁增厚、成纖維細胞增生等Ⅱ級肺泡炎表現(xiàn)。第28天可見肺間質(zhì)內(nèi)有大量散在的膠原纖維，肺泡隔增寬明顯，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，有許多成纖維細胞等肺間質(zhì)纖維化病變，即造模晚期為肺間質(zhì)纖維化，纖維結(jié)締組織增生明顯，基質(zhì)膠原聚集，取代了正常的肺組織結(jié)構(gòu)。隨著時間的變化，肺組織的的炎癥反應(yīng)程度，纖維化程度及量化結(jié)果(如圖3)所示。隨著造模時間的延長，肺纖維化的程度逐漸增加，Masson染色結(jié)果中第14天的相對纖維化為6.03±0.85，第28天的相對纖維化為12.77±1.24。Sirius Red染色結(jié)果中第14天的相對纖維化為4.91±1.02，第28天的相對纖維化為7.41±1.08。

圖2 薯蕷皂苷對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠的肺系數(shù)、 T-AOC和HYP的影響

圖3 BLM誘導(dǎo)大鼠肺組織纖維化的病理學(xué)染色結(jié)果 (200 ×，n=3) 1. 肺泡間隔增寬；2. 纖維(藍色)；3. 肺泡結(jié)構(gòu)破壞；4. 纖維(紅色)

薯蕷皂苷處理組(Dio 60、30和15 mg/kg)小鼠的以上癥狀得到明顯改善，肺組織的H&E，Masson和Sirius red染色(如圖4)所示?？诜硎氃碥蘸?，大鼠肺組織中膠原明顯減少(P<0.05)，纖維化程度降低，肺泡結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，且成劑量依賴性。60 mg/kg組的Masson染色的相對纖維量由Model組的9.53±1.41降低至3.29±0.28。60 mg/kg組的Sirius red染色的相對纖維量由Model組的5.81±0.78降低至1.44±0.26。以上結(jié)果表明薯蕷皂苷可以有效改善BLM誘導(dǎo)的肺組織病理學(xué)變化，減少纖維化的發(fā)生。

圖4 薯蕷皂苷對大鼠肺組織病理學(xué)染色(H&E、Masson和Sirius Red)的結(jié)果(200×)

三、 各組大鼠肺組織關(guān)鍵蛋白的表達

大鼠肺組織Western blot檢測結(jié)果(如圖5)所示，與BLM模型組相比，Dio15 mg/kg, 30 mg/kg和60 mg/kg給藥組中，TGF-β1，F(xiàn)oxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，薯蕷皂苷能明顯下調(diào)肺纖維化大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，薯蕷皂苷體內(nèi)抑制肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展與TGF-β1/Foxo3a信號通路相關(guān)。

圖5 薯蕷皂苷對肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1，F(xiàn)oxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表達

討 論

IPF是一種進行性異質(zhì)性肺病，患病后肺呼吸功能嚴(yán)重受損，治愈率較低，最終患者會因呼吸衰竭而死亡。臨床上用于治療該疾病的藥物包括尼達尼布、吡非尼酮、免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇激素等西藥，還包括藏紅花、黃芪、丹參和五味子等中藥，但藥物的選擇仍有限，治療效果仍不理想。因此，探尋肺纖維化的有效治療藥物成為當(dāng)下醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點。BLM誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型模擬了IPF的臨床病理特征，常被用于IPF治療藥物的藥效學(xué)和分子機制研究。在本研究中，我們建立了BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型來評價薯蕷皂苷的抗肺纖維化活性，而肺系數(shù)、T-AOC、HYP以及病理學(xué)染色結(jié)果均表明，薯蕷皂苷對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化具有顯著的保護作用。

IPF的病理機制仍不明確，但其發(fā)生和發(fā)展與許多細胞因子、炎癥介質(zhì)有關(guān)，這些細胞因子和炎癥介質(zhì)之間相互作用，相互協(xié)調(diào)，形成一個復(fù)雜而多變的分子網(wǎng)絡(luò)，在肺纖維化形成中起著重要的作用[8]。TGF-β1在肺纖維化發(fā)病過程中，起著中樞調(diào)控的重要作用，是作用最強的致纖維化因子，而且參與調(diào)控發(fā)病機制非常明確，TGF-β1能誘導(dǎo)大量成纖維細胞增殖分化為肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞對細胞凋亡有抵抗作用，并在成纖維細胞病灶的活動性纖維化部位聚集，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)的過多產(chǎn)生和沉積[9-11]。BLM可以誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生，導(dǎo)致TGF-β1升高，促進肺部炎癥反應(yīng)，增加炎性細胞的數(shù)量，而薯蕷皂苷則可以顯著減少TGF-β1的表達，緩解肺部炎癥，抑制肺纖維化的發(fā)生。

近年研究表明，F(xiàn)OX (forkhead box protein)家族是調(diào)控上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[12]，其中Foxo3a (forkheadbox protein O3a)是參與纖維化的發(fā)生發(fā)展的重要成員[13]。Foxo3a在TGF-β誘導(dǎo)的腎上腺皮質(zhì)轉(zhuǎn)分化中具有重要作用，另有研究發(fā)現(xiàn)Foxo3a參與了肺纖維化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的過程，是特發(fā)性纖維化治療的重要靶點，參與體內(nèi)凋亡、氧化應(yīng)激等多種病理生理過程的調(diào)節(jié)[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLM可以促進Foxo3a表達，而薯蕷皂苷可以顯著降低Foxo3a的表達。此外，F(xiàn)oxo3a可以激活NF-kB，調(diào)控多種炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄[16]。NF-κB在炎癥反應(yīng)調(diào)控中起核心作用，P65是其重要的功能亞單位，NF-κB的過度活化，會導(dǎo)致細胞因子、趨化因子基因表達增高，導(dǎo)致肺纖維化[17-18]。P65表達的增加可以誘導(dǎo)ICAM-1[19]，ICAM-1在炎性細胞及肺泡上皮的表達增加，提示其參與肺纖維化的肺組織的炎癥與修復(fù)過程[20-22]。薯蕷皂苷可以減少BLM導(dǎo)致大鼠肺組織中的Foxo3a及其下游P65和ICAM-1的表達，即薯蕷皂苷通過調(diào)控炎癥反應(yīng)抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化以遏制纖維化發(fā)展。因此，我們認(rèn)為薯蕷皂苷主要是通過抑制TGF-β1的表達進而調(diào)控Foxo3a的表達減輕肺纖維化上皮間質(zhì)分化，調(diào)控炎癥反應(yīng)而發(fā)揮對肺纖維化保護作用。

本文研究結(jié)果表明薯蕷皂苷可以顯著減輕BLM誘導(dǎo)的肺組織結(jié)構(gòu)破壞及間質(zhì)纖維化，對BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化具有顯著保護作用，該作用可能是通過調(diào)控TGF-β1/Foxo3a信號通路實現(xiàn)的。