絲球小奧德蘑白色菌株特異性標(biāo)記開發(fā)*

崔玉進 ，榮成博 ，高 琪 ，董永強 ，3，宋慶港 ，劉 宇，宋忠娟，王守現(xiàn)**

[1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；2.北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系，北京 100094；4.京科智寶（北京）農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 100097]

小奧德蘑屬（Oudemansiella） 包括卵孢小奧德蘑 （Oudemansiella raphanipes）、絲球小奧德蘑（Oudemansiella apalosarca）、褐褶邊小奧德蘑（Oudemansiella brunneomarginata）、擬粘小奧德蘑（Oudemansiella submucida）、厚褶小奧德蘑（Oudemansiella crassifolia）、鱗柄小奧德蘑（Oudemansiella furfuracea） 等多個種[1-6]，子實體菌蓋色澤多樣，包括褐色、灰色、白色、土黃色等，且富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、多種維生素及礦物質(zhì)元素，具有抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[7-8]。因此，小奧德蘑屬是一類適宜觀光采摘、具有健康功能的珍稀食用菌，迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于小奧德蘑栽培生產(chǎn)的報道相對較少。國內(nèi)主要栽培的品種為卵孢小奧德蘑，該品種栽培中存在的主要問題是出菇需覆土，工作量大，重茬問題嚴(yán)重，菌袋后熟時間長，約30 d?45 d，出菇周期長[9]。絲球小奧德蘑是新馴化成功的一類食藥兼優(yōu)且具有較高商品價值的珍稀食用菌，具有菌絲生長速度快、出菇周期短、不需覆土等優(yōu)點，充分彌補了卵孢小奧德蘑的不利因素，但目前尚無成熟的廣泛栽培品種。絲球小奧德蘑菌株JZB2115081菌株子實體白色，原基多，但菌柄短，易開傘，產(chǎn)量低，不適于生產(chǎn)栽培；JZB2115055菌株具有產(chǎn)量高、味道鮮美等優(yōu)點，但子實體整齊度不高。為了增加小奧德蘑屬優(yōu)良栽培品種的多樣性，選育兼具2種菌株優(yōu)點的高產(chǎn)、潔白、商品性狀好的絲球小奧德蘑雜交新菌株勢在必行。

絲球小奧德蘑菌株JZB2115055和菌株JZB2115081菌落特征相似，且鎖狀聯(lián)合較少不易觀察，增加了雜交菌株的鑒定難度。因此研究擬開發(fā)絲球小奧德蘑菌株JZB2115081的特異性擴增標(biāo)記，準(zhǔn)確、快速地對2個菌株的雜交后代進行鑒定，篩選具有菌株JZB2115081特性且兼有菌株JZB2115055優(yōu)良性狀的雜交新菌株，縮短育種周期，為其他食用菌優(yōu)良菌株的選育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

菌株JZB2115055和菌株JZB2115081經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所郝艷佳博士鑒定均為絲球小奧德蘑（Oudemansiella apalosarca）。采用PDA綜合培養(yǎng)基對野外采集的子實體進行組織分離，3 d?5 d菌絲萌發(fā)后轉(zhuǎn)管，置于25℃下避光培養(yǎng)，多次純化后獲得母種，菌絲潔白。

野生和人工栽培的子實體形態(tài)見圖1和圖2，供試菌株具體信息見表1。

圖1 菌株JZB2115055與菌株JZB2115081的野生子實體Fig.1 The fruit bodies of strain JZB2115055 and JZB2115081 in nature

圖2 菌株JZB2115055與菌株JZB2115081的人工栽培子實體Fig.2 The cultivated fruit bodies of strain JZB2115055 and JZB2115081

表1 試驗所用菌株Tab.1 Strains used in the experiment

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g去皮，切成1 cm3小塊后用開水煮至熟而不爛，用紗布過濾后在液體中加入瓊脂20 g，加熱完全溶解后再加入葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、VB110 mg，去離子水1 L，將上述物質(zhì)全部加熱溶解后裝入三角瓶中，121℃高壓滅菌30 min。

LB MILLER瓊脂和LB MILLER肉湯購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)

用PDA綜合培養(yǎng)基25℃條件下暗光培養(yǎng)絲球小奧德蘑菌株JZB2115055與JZB2115081菌絲。

1.2.2 絲球小奧德蘑菌株的DNA提取

菌絲長好后，分別刮取2個菌株的菌絲100 mg，采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取DNA；用紫外可見光分光光度計檢測DNA濃度，將2個菌株的DNA濃度調(diào)到20 μg·mL-1?50 μg·mL-1，并保持一致；-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

選擇27種ISSR引物分別以2個菌株的DNA為模板進行PCR擴增。所用的ISSR引物的序列詳見表2。

表2 試驗所用ISSR引物序列Tab.2 Sequence of ISSR primers used in the experiment

反應(yīng)總體積為 50 μL，含有 25 μL 2× Taq PCR Master Mix，10 μmoL·L-1引物 （各 2 μL），DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水補充總體積至50 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL離心管中，混勻放入PCR儀中。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性4 min，循環(huán)參數(shù)為94℃變性 30 s，48℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，共35個循環(huán)，72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，引物ISSR807和ISSR812與2個菌株DNA的PCR體系凝膠電泳見圖3和圖4。

將菌株JZB2115081的特異性片段進行切膠回收，與pMD19-T載體的連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗證連接正確后委托北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.4 特異性引物開發(fā)

獲得測序結(jié)果后利用DNAman軟件設(shè)計引物，引物長度為18 bp?25 bp，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物驗證PCR反應(yīng)的體系為：總體積為 25 μL，含有 12.5 μL 2 × Taq PCR Master Mix，10 μmoL·L-1引物 （各 1 μL），DNA 1 μL，加滅菌雙蒸水補充總體積至25 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL離心管中，混勻放入PCR儀中進行PCR擴增。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性4 min，循環(huán)參數(shù)為 95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。

圖3 引物ISSR807分別與2個菌株DNA的PCR體系凝膠電泳圖Fig.3 PCR amplification results of primer ISSR 807 and DNA of two strains

2 結(jié)果與分析

2.1 絲球小奧德蘑菌株JZB2115081特異性序列的獲得

27對ISSR引物共篩選出10條絲球小奧德蘑菌株JZB2115081相對于菌株JZB2115055的特異性擴增片段，經(jīng)克隆測序獲得了7條特異性的DNA序列，并以這些特異性序列為模板設(shè)計了7對引物，見表3。

圖4 引物ISSR812分別與2個菌株DNA的PCR體系凝膠電泳圖Fig.4 PCR amplification results of primer ISSR 812 and DNA of two strains

表3 7對設(shè)計得到的引物Tab.3 7 pairs of primers designed

2.2 ISSR篩選絲球小奧德蘑特異性引物

從7對引物中，共得到2對可特異性區(qū)分絲球小奧德蘑菌株JZB2115081與絲球小奧德蘑菌株JZB2115055的序列特異性擴增標(biāo)記，命名2對引物序列分別為8071F/R、8122F/R，見表4。

表4 2對特異性引物Tab.4 2 pairs of specific primers

以2個菌株DNA為模板，用8071F/R、8122F/R、ITS、無特異性引物進行擴增后的凝膠電泳圖見圖5。

如圖5所示，上述2對序列特異性擴增標(biāo)記在以絲球小奧德蘑菌株JZB2115081的DNA為模板擴增后各有一條DNA條帶，2條DNA片段大小在400 bp?500 bp，條帶大小分別為474 bp和428 bp。絲球小奧德蘑菌株JZB211505的DNA則無擴增條帶。同時以2個菌株DNA為模板，用ITS引物、無特異性引物分別進行擴增來做為陽性對照，2個菌株都有相應(yīng)的ITS引物條帶和無特異性條帶，證明提取的DNA效果良好。

圖5 2對特異性引物與陽性對照PCR體系凝膠電泳圖Fig.5 PCR amplification results of 2 pairs of specific primers and positive control

3 討論

食用菌常見的育種方法包括雜交育種[10]、選擇育種[11]、誘變育種[12]和原生質(zhì)體融合育種[13]等。其中雜交育種是獲取優(yōu)質(zhì)新品種方法中比較常用和有效的方法之一，該方法可以迅速獲得新的農(nóng)藝性狀并具有簡便、高效、目的性強等優(yōu)勢[14]。

目前如何高效篩選出在雜交育種中無明顯鎖狀聯(lián)合的成功雜交菌株是加快食用菌雜交育種效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的鑒定方法要根據(jù)菌株的形態(tài)特征或生化指標(biāo)等進行區(qū)分鑒定，但該方法耗費時間長且易受環(huán)境和個別菌株自身生理差異影響，實際應(yīng)用過程中存在諸多困難。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)開發(fā)出了多種基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記輔助食用菌育種。如林范學(xué)等[15]運用隨機擴增多態(tài)（RAPD）技術(shù)對來源于2個香菇（Lentinus edodes） 雙核菌株的孢子單核體、原生質(zhì)體單核體及其雜交后代進行分析。結(jié)果表明，用9個隨機引物共擴增出116條DNA片段，其中82.5%具有多態(tài)性。綜合分析9個隨機引物的擴增譜帶，可將所有供試親本的單核體清楚分開，且單核體聚類分析結(jié)果與其來源及遺傳背景相吻合。此外，用2個雙核親本菌株的4個不同交配型孢子單核體兩兩交配，所得的雜交組合也可與雙核親本菌株明確地區(qū)分開來。余志晟等[16]應(yīng)用限制性片段長度多肽 （RFLP） 技術(shù)對 12株草菇（Volvariella volvacea）菌株的核糖體、線粒體和基因組總DNA的多態(tài)性進行了研究，結(jié)果表明供試菌株間遺傳差異很小，為草菇的育種提供資料。榮成博等[17]利用特征片段擴增區(qū)域（SCAR）技術(shù)研究開發(fā)了特異性引物對P826-1-2XF/R，從而實現(xiàn)了對絲球小奧德蘑菌株JZB2115055的快速鑒定和保護。簡單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）引物和相關(guān)序列擴增多肽性（SRAP）引物在食用菌育種過程親本親緣關(guān)系的分析中也有應(yīng)用。武海月等[18]應(yīng)用ISSR引物、SRAP引物將19個供試榆黃蘑（Pleurotus citrinopileatus）菌株分為四大類，研究表明這19個供試菌株間具有較大的遺傳差異，聚類分析圖為雜交育種的親本選擇提供分子水平的依據(jù)。

小奧德蘑屬真菌的研究近些年主要集中于栽培與馴化方面，相關(guān)生活史、遺傳機理與育種研究鮮見報道，亟待通過育種定向解決實際生產(chǎn)中遇到的問題。本研究開發(fā)了JZB2115081菌株的特異性擴增分子標(biāo)記，以引物ISSR807和ISSR812擴增時，絲球小奧德蘑JZB2115081菌株各出現(xiàn)了一條區(qū)別于絲球小奧德蘑菌株JZB2115055的特異條帶，獲得這組條帶的DNA序列，以此DNA序列設(shè)計的2對特異性引物對8071F/R、8122F/R。在絲球小奧德蘑菌株JZB2115081中分別可以特異性的擴增出一條大小在400 bp?500 bp之間的條帶，長度分別為474 bp和428 bp，而這2對引物在絲球小奧德蘑菌株JZB2115055中未擴增出目的條帶。本引物為開展雙單雜交后代的鑒定提供了快速、準(zhǔn)確的方法，節(jié)省了獲得菇型好、顏色潔白、產(chǎn)量高的絲球小奧德蘑優(yōu)質(zhì)新菌株的時間，拓寬了相關(guān)育種工作的思路，為加快其他品種食用菌的育種進程提供了解決方案。

絲球小奧德蘑菌株除可以在一定程度上豐富我國當(dāng)前食用菌市場種類多樣性外還具有較高的醫(yī)療開發(fā)潛力，絲球小奧德蘑的菌絲體乙酸乙酯提取物可抑制克魯斯式念珠菌（Candida krusei）、絲球念珠菌（Candida tropicalis）、光滑念珠菌 （Candida glabrata）活性[19]，還可抑制人腎癌細(xì)胞（TK-10）、人淋巴細(xì)胞的活性和增殖[20]。絲球小奧德蘑在提供食用價值的同時也是一座極具開發(fā)潛力的藥用資源寶庫。

我國幅員遼闊，菌類資源豐富，食用菌市場廣闊，目前尚有很多類食用菌未實現(xiàn)人工栽培或未選育出適宜規(guī)?；耘嗟钠贩N，對于這部分珍稀食用菌品種的馴化和選育也必將成為以后的科研熱點。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的區(qū)分絲球小奧德蘑菌株JZB2115081和菌株JZB2115055的特異性標(biāo)記序列8071F/R、8122F/R，可直接通過PCR擴增鑒定雜交結(jié)果，大大加快育種進程，實現(xiàn)了簡便快速鑒定菌株雜交結(jié)果的目的，為進一步加快實現(xiàn)絲球小奧德蘑白色高產(chǎn)雜交菌株的育種研究提供依據(jù)。