溫度和光照對平菇酪氨酸酶活力的影響及與子實體顏色的關(guān)系*

上官端琳，龔鳳萍，段慶虎，竹 瑋，易宏巖，冉忠萍，張應(yīng)香

（信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000）

平菇 （Pleurotus ostreatus），側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus） 真菌，是消費青睞的大宗食用菌之一，其子實體顏色是消費者選擇的重要標準之一，有的消費者喜歡白色品種，有的喜歡黑色品種。因此，子實體顏色常常是育種者考慮的主要因素之一。在平菇栽培管理過程中發(fā)現(xiàn)，平菇子實體顏色因溫度和光照強度的不同而深淺不一，說明溫度和光照強度對平菇子實體顏色深淺有一定影響。查閱食用菌栽培相關(guān)文獻得知，光照強度對食用菌菌絲生長、出菇、產(chǎn)量、子實體形態(tài)特征及色澤等方面均有影響[1]。張桂香等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)香菇在過強的光照下無法正常轉(zhuǎn)色或轉(zhuǎn)色期延長，金針菇會隨著光照強度增加，菇體色澤逐漸加深，菌蓋變大，褐斑增多，菌柄變粗變短，商品價值變低。何莉莉等[3]在研究溫度和光照對鮑魚菇生長發(fā)育影響中發(fā)現(xiàn)，鮑魚菇在100 lx散射光下原基分化較好，速度快，形態(tài)粗壯，數(shù)量多。吳懼等[4]在研究光對靈芝生長發(fā)育影響時發(fā)現(xiàn)，不同生長發(fā)育期對光的要求不同，光線對菌絲生長有抑制作用，子實體發(fā)育的最適光強與產(chǎn)孢期不同。韓建榮[5]在對木耳子實體生長階段酪氨酸酶活性與溫度光照和子實體顏色關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，木耳子實體顏色的變化原因之一是由于溫度和光照強度對酪氨酸酶活力的影響，造成子實體中黑色素的含量不同，而子實體中黑色素含量高則顏色深。羅茂春等[6]在光質(zhì)對紅平菇菌絲體和子實體生長發(fā)育影響的研究中也表明，光照時間和光照強度對紅平菇子實體顏色和產(chǎn)量有影響。對于平菇子實體顏色，有研究表明，平菇子實體顏色是數(shù)量性狀[7]，受環(huán)境因素影響較大；平菇子實體顏色主要與黑色素的代謝有關(guān)，酪氨酸酶是影響黑色素代謝的主要酶類之一[8]。

鑒于上述情況，結(jié)合相關(guān)文獻論述，猜測平菇子實體顏色的深淺是由于栽培環(huán)境條件改變酪氨酸酶的活力，從而影響子實體中黑色素合成的量。該試驗通過研究溫度和光照強度對平菇子實體顏色深淺的影響，以期找到平菇子實體顏色深淺與溫度、光照強度之間的關(guān)系，為平菇定向育種及工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)平菇建立科學(xué)的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：平99，由信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院保藏。

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂粉2%。121℃高壓蒸氣滅菌30 min備用。

原種培養(yǎng)基：麥粒98%、石膏2%。

栽培種培養(yǎng)基：棉籽殼98%、石灰2%，料水比1∶1.2。料水拌勻后裝袋，121℃高壓蒸氣滅菌2 h備用。

栽培培養(yǎng)基：棉籽殼98%、石灰2%，料水比1∶1.2。料水拌勻后起堆發(fā)酵，堆高0.8 m，寬2 m，長度不限。堆好后，在堆上每間距30 cm處打密集透氣孔，當堆溫達65℃時翻堆1次，如此翻堆2次后晾涼、裝袋，常壓蒸汽蒸料，待料溫達到93℃時?；馉F4 h～5 h備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度對平菇酪氨酸酶活力的影響及與子實體顏色的關(guān)系

將滿袋的平菇菌袋轉(zhuǎn)入環(huán)境條件適宜，溫度分別為15℃、18℃、25℃、自然溫度的出菇房中進行出菇管理，記錄平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子實體顏色并取基質(zhì)測定酪氨酸酶活力。

1.2.2 光照強度對平菇酪氨酸酶活力的影響及與子實體顏色的關(guān)系

將滿袋的平菇菌袋轉(zhuǎn)入環(huán)境條件適宜，光照強度分別為100 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx、2 500 lx的出菇房中進行出菇管理，記錄平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子實體顏色并取基質(zhì)測酪氨酸酶活力。

1.2.3 溫度和光照強度正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取3個溫度、3個光照強度為正交試驗水平進行正交試驗，記錄平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子實體顏色并取基質(zhì)測成熟期酪氨酸酶活力。

1.2.4 酪氨酸酶活力的測定

取待測樣品5.0 g，加入pH 7.2的Na2HPO4-HCl緩沖溶液 20 mL，4℃、200 r·min-1提取 4 h，4℃、8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即為粗酶液。在試管中加入濃度為0.01 mol·L-1多巴溶液0.5 mL及pH 6.0磷酸緩沖液2.5 mL，30℃水浴10 min，加1 mL粗酶液搖勻，立即于分光光度計480 nm處測定吸光度值A(chǔ)，以吸光度值增加0.001為1個酶活單位，不加多巴溶液（以磷酸緩沖液替代） 為對照，計算原料中酪氨酸酶活力。粗酶液酶活力（U1，U·mL-1）計算公式為：

式中：A為樣品吸光度值；A對照為對照吸光度值；t為反應(yīng)時間（min）；V1為粗酶液體積（mL）。

原料中酪氨酸酶活力（U2，U·g-1）計算公式為：

式中：V為粗酶液總體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel和Origin 8軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對平菇酪氨酸酶活力的影響及與子實體顏色的關(guān)系

在不同溫度下，平菇“平99”的菇蕾期、成熟期、老化期子實體菌蓋顏色見表1，酪氨酸酶活力見圖1。

表1 溫度對子實體顏色的影響Tab.1 Effects of temperature on fruit body color

圖1 栽培環(huán)境溫度對酪氨酸酶活力的影響Fig.1 Effects of cultivation environment temperature on tyrosinase activity

由表1可以看出，在同一溫度的不同生長時期，平菇菇蕾期的子實體顏色最深，隨著子實體成熟，顏色逐漸變淺；平菇在成熟期的不同溫度條件下，子實體顏色基本隨溫度的升高而變淺，在15℃時子實體顏色最深，25℃時最淺。由圖1可以看出，在同一溫度的不同生長時期，酪氨酸酶活力基本在菇蕾期最高，隨著子實體成熟其酶活力降低；在同一生長期的不同溫度條件下，溫度<25℃時酪氨酸酶活力較強，酪氨酸酶催化酪氨酸轉(zhuǎn)化的黑色素較多，則子實體菌蓋顏色較深。因平菇產(chǎn)品在成熟期采摘，所以以成熟期的子實體顏色和酪氨酸酶活力為主要指標，選取15℃、18℃及自然溫度為正交試驗溫度水平。

2.2 光照強度對平菇酪氨酸酶活力的影響及與子實體顏色的關(guān)系

在不同光照強度條件下，平菇菇蕾期、成熟期、老化期子實體顏色見表2，酪氨酸酶活力見圖2。

表2 光照強度對子實體顏色的影響Tab.2 Effects of light intensity on fruit body color

圖2 栽培環(huán)境光照強度對酪氨酸酶活力的影響Fig.2 Effects of cultivation light intensity on tyrosinase activity

由表2可以看出，在同一光照強度的不同生長時期，平菇菇蕾期的子實體顏色最深，隨著子實體成熟，其顏色逐漸變淺；平菇在同一生長期的不同光照強度條件下，子實體顏色隨光照強度的增強呈先深后淺趨勢，在500 lx～1 500 lx時子實體顏色較深，其次是100 lx?500 lx，光照強度>1 500 lx時菌蓋顏色較淺。由圖2可以看出，在同一光照強度的不同生長時期，500 lx～2 500 lx時酪氨酸酶活力在菇蕾期最高，隨著子實體成熟其酶活力降低；在同一生長期光照強度≦1 500 lx時酪氨酸酶活力較強，催化酪氨酸轉(zhuǎn)化的黑色素較多，故子實體顏色較深。因平菇產(chǎn)品在成熟期采摘，所以以成熟期的子實體顏色和酪氨酸酶活力為主要指標，選取光照強度500 lx、1 000 lx、1 500 lx為正交試驗水平。

2.3 溫度和光照強度正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取溫度水平為15℃、18℃、自然溫度，光照強度水平為500 lx、1 000 lx、1 500 lx，正交試驗因素水平見表3。根據(jù)表3安排試驗組合，正交試驗分析見表4，平菇不同時期子實體顏色見表5。

表3 正交試驗因素水平Tab.3 Orthogonal experimental factors

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 Orthogonal experimental design and results

表5 不同時期子實體顏色Tab.5 Fruit body color of different periods

如表4所示，根據(jù)極差值的大小，各因素影響酪氨酸酶活力的主次順序為：溫度>光照強度；并得到每個因素的最好水平，即A1B2。因此，可以使酪氨酸酶活力最強的最佳栽培條件為：溫度15℃，光照強度1 000 lx。從表5可以看出，處理1（15℃，1 000 lx）的各個生長時期子實體顏色均較深，因子實體顏色是通過感官評價，顏色描述存在一定的誤差，所以以酶活為主要指標。綜合考慮選擇15℃、1 000 lx為最佳栽培條件。

3 結(jié)論與討論

試驗初步探索了平菇子實體顏色與溫度、光照強度之間的關(guān)系，結(jié)果表明，平菇可通過左旋多巴（levodopa，L-dopa） 途徑合成黑色素；溫度和光照強度通過影響與子實體顏色相關(guān)的酶（酪氨酸酶）的活力而影響子實體顏色；平菇酪氨酸酶活力在平菇子實體生長過程中逐漸降低，菇蕾期的酶活力最高，催化合成的黑色素最多，子實體顏色最深，該結(jié)論同張妍等[9]在佛羅里達側(cè)耳遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及菌蓋顏色性狀的QTL定位研究的結(jié)論（5個候選基因的表達量在菌絲期、幼菇期、成熟期、衰老期四個不同發(fā)育階段呈現(xiàn)一致的變化趨勢，且在菌蓋顏色最深的幼菇期表達量最高） 一致；栽培溫度為15℃、光照強度為1 000 lx時，平菇“平99”子實體顏色最深。

因食用菌黑色素合成途徑主要有L-dopa途徑（關(guān)鍵的酶為酪氨酸酶、漆酶）和DHN途徑（關(guān)鍵的酶為聚酮合成酶）2種途徑[8]。本試驗只初步探索了L-dopa途徑中的酪氨酸酶活力,平菇黑色素的主要合成途徑和黑色素合成過程中起決定性作用的酶尚不可知，本項目研究結(jié)果只能說明平菇的黑色素合成途徑有L-dopa途徑，酪氨酸酶是平菇合成黑色素的酶之一，且酪氨酸酶的活力受溫度和光照強度的影響，溫度是最主要因素。

下一步可以通過分子水平找到黑色素合成酶的相關(guān)基因，探索相關(guān)酶類基因表達水平與子實體顏色深淺的關(guān)系，以期在菌絲期初篩出期望的品種（黑色、灰色或白色），再通過控制環(huán)境條件（溫度和光照強度）進行出菇試驗，為平菇定向育種及工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菇提供參考及數(shù)據(jù)支撐。