體外模擬消化對茯苓不同藥用部位及代謝廢料的抗氧化活性影響*

王軍民，王 濤，楊 瑩，劉思遠(yuǎn)

（西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

中藥茯苓為傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 多孔菌科（Polyporaceae） 茯苓屬（Poria） 真菌茯苓 [Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，是我國傳統(tǒng)常用中藥材[1]。茯苓生長在松樹林植物群落中，靠吸收松樹根部營養(yǎng)而生長發(fā)育[2]。野生藥材目前已不能滿足市場需求，現(xiàn)多以人工栽培為主。人工栽培現(xiàn)主要有2種方式，其一是將菌絲接種于自然死亡或者被砍伐的松樹樹樁上并覆土，待其自然生長；其二是將菌絲接種于經(jīng)脫松脂、干燥后的松樹樹干上并埋于地下4 cm?6 cm[3]。茯神為茯苓塊中穿有堅實細(xì)松根者，來源于自生茯苓或第一種人工方式，長寬各4 cm?5 cm，松根直徑不超過1.5 cm，邊緣苓塊可不成方形。茯苓中間生長的松木如為彎曲的松根，似朽木狀，質(zhì)松體輕，每根直徑不超過2.5 cm，周圍帶有2/3的茯苓肉則稱之為茯神木[4]。

茯苓和茯神具有較好的生物活性[5]，但關(guān)于茯苓生長后剩余廢料（下文統(tǒng)稱代謝廢料）的利用卻未見報道，同時體外模擬消化前后茯苓各部分抗氧化活性的研究亦未見報道。茯苓皮載于《本草綱目》，味甘淡，性平，具有利水，消腫功效；茯苓（白茯苓）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、淡，性平，具有利水滲濕、健脾安神等功效；茯神載于《名醫(yī)別錄》，甘淡，平，具有寧心、安神、利水功效，用于心虛驚悸、健忘、失眠、驚癇、小便不利[6]。

為評價茯苓不同藥用部位茯苓皮、白茯苓以及茯苓代謝廢料、茯神內(nèi)松根（這4部分下文統(tǒng)稱茯苓不同藥用部位）被體外模擬消化后抗氧化活性的變化，綜合評價茯苓的表觀抗氧化能力，同時為研究茯苓代謝廢料的利用和生物活性，將不同樣品進(jìn)行胃、腸消化和吸收體外模擬試驗，采用DPPH自由基清除能力、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽自由基（ABTS） 清除能力、抗超氧陰離子自由基（O2-） 能力和羥基自由基（OH-） 清除能力等4種常用的體外抗氧化模型，研究茯苓樣品抗氧化能力在體外模擬消化后抗氧化能力的變化。從而為研究開發(fā)茯苓提供試驗依據(jù)，為茯苓代謝廢料開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 試驗材料

樣品采自云南省臨滄市雙江拉祜族佤族布朗族傣族自治縣茯苓栽培基地，茯苓母種為中科院5.78原種，栽培樹樁為思茅松砍伐半年后樹樁。茯苓采集后剝?nèi)『稚糠值玫杰蜍咂?；白色部分切丁干燥得到白茯苓；茯神切片后挖取?nèi)部松根得到茯神松根（下文統(tǒng)稱茯神）；茯苓采集后剩余樹樁為茯苓代謝廢料。上述材料粉碎后過20目篩備用。標(biāo)本保存在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院植物資源利用系藥用植物教研室。

1.2 儀器與試劑

Evolution 300紫外分光光度計，美國Thermo Fisher公司；SQP型萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XS105 DU十萬分之一分析天平，Mettler Toledo；DHG-9030 A型高溫干燥箱，杭州利輝環(huán)境檢測設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph Digital）；超聲波清洗器，巴克超聲波科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋，金壇市丹瑞；移液槍、容量瓶、樣品瓶，DPPH、ABTS、α-淀粉酶、胃蛋白酶3 000 U（豬胃黏膜）、胰蛋白酶250 U（豬胰）、膽酸鈉，上述試劑購于上海源葉生物公司；維生素C，北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，北京酷來搏科技有限公司；HCl，汕滇藥業(yè)有限公司；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、CaCl2、NaHCO3、Tris 試劑、K2S2O8、FeSO4·7H2O、水楊酸、鄰苯三酚、30%H2O2均為分析純購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 原材料的提取

取樣品各100 g放入圓底燒瓶中，分別以無水乙醇和蒸餾水按照料液比1∶10于90℃回流提取，樣品編號詳見表1。

表1 茯苓樣品提取方法及編號Tab.1 The sample number and extraction method of Poria cocos

2.2 體外模擬消化

2.2.1 消化液配制

1）模擬口腔消化液的配制

PBS緩沖液：精密稱取NaCl 8.006 g、KCl 0.201 g、Na2HPO4·12H2O 3.581 g、KH2PO40.204 g，去離子水溶解后定容到1 L，取α-淀粉酶0.910 g溶解至220 U·mL-1[7]。

2）胃模擬消化液的配制

胃電解質(zhì)溶液：精密稱取NaCl 3.10 g、KCl 1.10 g、CaCl20.150 g、NaHCO30.60 g，用蒸餾水溶解定容于1 L容量瓶中。

體外模擬胃液：0.67 g胃蛋白酶中加入0.9 L胃電解質(zhì)溶液，混合搖均后用1.00 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為2.0[7]。

3）腸模擬消化液的配制

腸電解質(zhì)溶液：NaCl 5.4 g、KCl 0.65 g、CaCl20.33 g溶于1 L去離子水中；胰酶溶液：7 g胰酶定溶于100 mL水；4%膽酸鈉溶液：4 g膽酸鈉定溶于196 mL水。

體外模擬腸液：100 mL胰酶溶液中加入100 mL腸電解質(zhì)溶液、200 mL膽鹽溶液和13 mg胰蛋白酶，混合均勻，用1 mol·L-1NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7.0[7]。

2.2.2 體外模擬消化流程

精密稱取茯苓不同樣品提取物1.0 g加蒸餾水定容至100 mL，得到濃度為10 mg·mL-1的樣品溶液進(jìn)行模擬消化，體外模擬消化方法參考miller[8]模擬消化方法并加改進(jìn)，具體流程見圖1。

相同條件以蒸餾水代替樣液為空白組，以蒸餾水代替消化液為對照組。

圖1 體外模擬消化流程Fig.1 Process of simulated digestion in vitro

2.3 抗氧化活性測試

2.3.1 不同濃度的樣品測試液的配制

分別取消化前后不同樣品的醇提物和水提物溶液，加對應(yīng)的提取溶劑稀釋為不同濃度的待測液備用，待測液濃度詳見表2。

表2 樣品溶液濃度Tab.2 Sample solution concentration

2.3.2 DPPH·清除能力的測定

參照Kaur[9]的方法改進(jìn)而來，分別吸取消化前后的待測液各0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL及陽性對照VC加入比色管中，加乙醇定容至2 mL，后加0.2 mmol·L-1DPPH溶液2 mL，避光室溫反應(yīng)30 min后用紫外分光光度計測定各組分樣品在517 nm處的吸光度值（A1）。對照組以2 mL無水乙醇溶液代替DPPH溶液，測吸光度值（A2）。空白組以等量無水乙醇代替各組分樣品溶液，重復(fù)同上步驟，測得吸光度值（A0）。每個分析樣品重復(fù)3次，取平均值。按公式（1） 計算DPPH·清除率（IDPPH，%）。以清除率（%） 為縱坐標(biāo)，樣品濃度（mg·mL-1） 為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程，計算清除率50%時樣品的半抑制濃度值（下文統(tǒng)稱IC50值）。DPPH·清除率（IDPPH，%） 公式為：

式中：A0為空白組吸光度值；A1為試驗組吸光度值；A2為對照組吸光度值。

2.3.3 ABTS+·清除能力的測定

參照Sun Q[10]的方法并加以改進(jìn)。測定精密配制ABTS（7 mmol·L-1） 溶液和過硫酸鉀水溶液（2.45 mmol·L-1），1∶1 （V/V） 混合，在室溫、避光條件下靜置12 h?16 h得到ABTS儲備液。使用前用無水乙醇逐級稀釋至在734 nm處的吸光度值為0.70±0.02時為標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別吸取消化前后的待測液各0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL及陽性對照VC加入比色管中，加乙醇定容至2 mL，后加入2 mL ABTS工作液，混合均勻，室溫下反應(yīng)6 min，在波長734 nm處測定各組分樣品的吸光度值（B1）?？瞻讓φ沼脽o水乙醇2 mL代替ABTS工作液，步驟同上，于波長734 nm處測得各組分樣品本身吸光度值（B2）。以2 mL無水乙醇與2 mL ABTS工作液充分混合，重復(fù)同上步驟，測其在734 nm波長處的吸光度值（B0）。以VC作陽性對照，重復(fù)3次，取平均值。計算ABTS+·清除率，并計算不同樣品的IC50值，ABTS清除率（IABTS，%） 公式為：

式中：B0為空白組吸光度值；B1為試驗組吸光度值；B2為對照組吸光度值。

2.3.4 ·OH清除能力的測定

參照韋玉蘭等[11]的方法。分別吸取消化前后的待測液各0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL及陽性對照VC加入比色管中，加乙醇定容至1 mL，依次加入 6 mmol·L-1的 FeSO4·7H2O 溶液、6 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液、6 mmol·L-1H2O2溶液各200 μL并補蒸餾水至4 mL充分混勻，室溫放置1 h后在波長510 nm處測定其各組分樣品吸光度值（C1）。用相同體積的無水乙醇代替待測樣品液，重復(fù)上述步驟，于波長510 nm處測得吸光度值（C0）。以等體積蒸餾水作為參比液調(diào)零。以VC作對照，每個分析樣品重復(fù)3次，取平均值。計算羥基自由基清除率，并計算不同樣品的IC50值，·OH清除率（IOH，%） 公式為：

式中：C0為空白組吸光度值，C1為試驗組吸光度值。

參照趙宏等[12]方法，分別吸取消化前后的待測液各0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL及陽性對照VC加入比色管中，加乙醇定容至1 mL，分別加 0.1 mol·L-1的 Tris-HCl緩沖溶液 （pH 7.8，2 mmol·L-1EDTA） 4 mL，加入25℃水浴條件下恒溫20 min 的 6 mmol·L-1鄰苯三酚工作液 50 μL，混勻后在波長325 nm處檢測，以30 s為梯度在4 min內(nèi)測得吸光度值Di（i=1……9），以吸光值Di對反應(yīng)時間t作線性關(guān)系圖，斜率即為ΔD1。以1 mL乙醇做空白對照重復(fù)上操作步驟，最后計算4 min內(nèi)鄰苯三酚每分鐘吸光度值的變化率（ΔD0）。以等體積Tris-HCl緩沖溶液作為參比液調(diào)零。以VC作陽性對照，每個分析樣品重復(fù)3次，取平均值。計算清除率，并根據(jù)清除率計算不同樣品的IC50值，清除率（IO2，%） 公式為：

式中：ΔD0為對照組吸光度變化值；ΔD1為試驗組吸光度變化值。

2.4 多酚類物質(zhì)提取與檢測

4個樣品粉碎后各取18 g分為2份，濾紙包裹后置索氏提取器內(nèi)，加石油醚進(jìn)行脫脂處理，1份加入200 mL的75%乙醇回流提取2 h過濾，殘渣重復(fù)提取2次。合并濾液減壓濃縮，提取物預(yù)凍后放入冷凍干燥機進(jìn)行干燥；另一份加入200 mL蒸餾水回流提取2 h過濾，殘渣重復(fù)提取2次。合并濾液減壓濃縮，提取物預(yù)凍后放入冷凍干燥機進(jìn)行干燥[13]。

茯苓不同部位總可溶多酚化合物的提取參照王靜等[14]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，提取流程如下：各部位凍干粉末平均分為3份，各取1份濾紙包裹后加入50 mL的75%丙酮避光浸泡30 min后超聲提取20 min，離心后取上清液，重復(fù)3次，合并定容后即得待測液。采用福林酚法測定多酚含量[15]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

總酚的提取重復(fù)3次，計算提取率。用SPSS version 17.0軟件計算不同樣品對自由基的清除率為50%時的濃度（IC50值），結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差?？偡雍颗c采用DPPH·、ABTS+·、、·OH自由基清除能力法測定的抗氧化活性的相互關(guān)系以及不同測定方法的關(guān)系采用Excel 2010中的Correl函數(shù)進(jìn)行計算得到相關(guān)性。

3 試驗結(jié)果

3.1 體外模擬消化后茯苓各部分活性變化

3.1.1 DPPH·清除能力

茯苓各部分提取物體外模擬消化前后DPPH·清除能力統(tǒng)計見圖2。

圖2 體外模擬消化對茯苓各部分DPPH·清除能力的影響Fig.2 Effects of in vitro simulated digestion on the DPPH·radicals scavenging ability in each part of Poria cocos

由圖2所示，消化前茯苓各部分提取物DPPH·清除能力由高到低依次為E4>E3>W4>W3>E1>W1>E2>W2，消化后自由基清除能力由高到低依次為E4>W3>E3>W4>E1>W1>W2>E2。體外模擬消化對茯苓各部分DPPH·清除能力影響較大，通過計算IC50值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，除茯苓代謝廢料水提物、白茯苓醇提物在消化后清除能力有所下降外其他樣品對自由基清除能力有所增強。其中茯苓代謝廢料醇提部分自由基清除能力最強，消化前IC50值為（0.047±0.001 3） mg·mL-1，消化后自由基清除能力有所提升，其濃度降低為（0.021±0.002 0） mg·mL-1，活性超過陽性對照VC。茯神醇提物在消化后自由基清除能力提高明顯，消化后樣品IC50值為（0.015±0.001 0）mg·mL-1亦超過陽性對照VC活性。

3.1.2 ABTS+·清除能力

茯苓各部分提取物ABTS+·清除能力統(tǒng)計見圖3。

圖3 體外模擬消化對茯苓各部分ABTS自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of in vitro simulated digestion on the ABTS radicals scavenging ability in each part of Poria cocos

由圖3可知，消化前茯苓各部分提取物ABTS+·清除能力由高到低依次為E4>E3>W4>W3>E1>W1>W2>E2，消化后自由基清除能力由高到低依次為E4>E3>E1>W4>W3>E2>W1>W2。通過計算IC50值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)體外模擬消化對茯苓各部分ABTS+·清除能力都有顯著提高。白茯苓醇提物和水提物增長較為明顯，其IC50值分別由未消化前的（0.59±0.003 1）mg·mL-1和 （0.53± 0.003 0） mg·mL-1降至 （0.027±0.000 28） mg·mL-1和 （0.039±0.000 19） mg·mL-1，消化對白茯苓ABTS+·清除能力影響較大；茯神和茯苓代謝廢料醇提物分別由消化前的IC50值（0.008 4±0.000 75） mg·mL-1和 （0.003 3 ±0.000 54） mg·mL-1降至 （0.002 2±0.001 1） mg·mL-1和 （0.001 4±0.001 2） mg·mL-1，活性超過陽性對照VC（0.002 9±0.000 04） mg·mL-1。

3.1.3 ·OH清除能力測定

茯苓各部分提取物·OH清除能力統(tǒng)計見圖4。

圖4 體外模擬消化對茯苓各部分·OH清除能力的影響Fig.4 Effects of in vitro simulated digestion on the·OH radicals scavenging ability in each part of Poria cocos

由圖4所示，消化前茯苓各部分提取物·OH清除能力由高到低依次為E4>E3>E1>W1>E2>W3>W4>W2，消化后自由基清除能力由高到低依次為E4>E3>E1>W3>W2>E2>W1>W4。體外模擬消化對茯苓各部分·OH清除能力都有一定提高。通過計算IC50值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，茯苓各部分提取物在消化后IC50值降低明顯。其中茯苓代謝廢棄物醇提部分消化前后活性強于陽性對照VC，而茯神醇提物在消化后活性強于陽性對照VC。

圖5 體外模擬消化對茯苓各部分抗能力的影響Fig.5 Effect of in vitro simulated digestion on the resistance of of each part of Poria cocos

3.2 體外模擬消化后多酚含量變化

試驗采用福林酚顯色法檢測體外模擬消化前后茯苓不同部位的總酚含量變化，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，于725 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為：

線性方程中R2=0.998 6，濃度X與吸光度Y在0.01 mg·mL-1?0.1 mg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)線性方程計算體外模擬消化前后茯苓各部分的總酚含量，結(jié)果見圖6。

圖6 體外模擬消化對多酚含量的影響Fig.6 The effect of in vitro simulated digestion on the content of polyphenols

由圖6可知，體外模擬消化前茯苓各部分總多酚含量依次為E4>E3>W4>W3>E1>W1>E2>W2，消化前茯苓代謝廢料多酚含量最高為8.4%，最低為白茯苓約為0.28%，多酚含量變化的差異來源于各部分材料組成的不同，茯苓代謝廢料與茯神主要含有松木及少量茯苓菌絲，而松樹本身多酚類物質(zhì)含量較高，這與文獻(xiàn)報道一致[16]。

經(jīng)體外模擬消化后總酚含量整體呈增加趨勢，與文獻(xiàn)[17]報道的“消化酶可以降低多酚類物質(zhì)分子之間的相互作用力，從而促進(jìn)多酚的釋放”的結(jié)論一致。但是茯苓代謝廢料水提和醇提部分經(jīng)體外模擬消化后總酚含量降低，這可能與原材料經(jīng)過茯苓代謝，多酚類成分可以自由釋放導(dǎo)致模擬消化不能促進(jìn)其進(jìn)一步的釋放，而消化酶會破壞和轉(zhuǎn)化一定的多酚。而抗氧化試驗結(jié)果表明經(jīng)消化后二者抗氧化活性增加，其原因可能是在模擬消化過程中促進(jìn)了其他抗氧化活性物質(zhì)的釋放，與文獻(xiàn)[17]報道的體外模擬消化可以顯著的促進(jìn)黃酮等抗氧化活性成分的釋放結(jié)論一致。

3.3 茯苓不同部位抗氧化活性與多酚的相關(guān)性研究

為研究茯苓不同部位多酚含量與抗氧化活性間的關(guān)系，利用Correl函數(shù)進(jìn)行計算并得到體外模擬消化前后茯苓不同部位多酚含量與抗氧化活性的相互關(guān)系見表3。多酚含量與抗氧化活性相關(guān)性研究中抗氧化活性數(shù)據(jù)采用樣品IC50值進(jìn)行相關(guān)性分析，分析表明多酚含量越高樣品IC50值越低，其絕對值越接近于1則其相關(guān)性越高，絕對值越接近于0說明相關(guān)性越小乃至不相關(guān)[18]。

表3 總酚含量及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between total phenol content and antioxidant activities

由表3可知，茯苓不同部位多酚含量與以ABTS+·、DPPH·、·OH法測定的抗氧化活性具有很高的負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.869 3、-0.834 5以及-0.693 5，表明多酚含量越高樣品IC50值越低；多酚含量與抗能力具有一定的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)為-0.550 7。體外模擬消化后，茯苓不同部位多酚含量與以ABTS+·、·OH法測定的抗氧化活性相關(guān)性提高，其中多酚含量與以ABTS+·法測定的抗氧化活性相關(guān)性達(dá)到-0.911 9。而與以DPPH·、的抗氧化活性相關(guān)性降低。ABTS+·法測定的抗氧化活性與DPPH·、、·OH法測定的抗氧化活性的相關(guān)性均高于0.6，表明該法測定茯苓不同部位多酚的抗氧化活性較為穩(wěn)定；但是測定的抗氧化活性與DPPH·、ABTS+·、·OH法測定的抗氧化活性的相關(guān)性除與ABTS+·法高于0.6外，其他方法相關(guān)性均較低。由此可以看出多酚類化合物含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性與抗氧化活性測定的方法有關(guān)，與文獻(xiàn)報道一致[19]。

4 結(jié)論

為研究茯苓不同部位不同溶劑提取物的抗氧化活性以及體外模擬消化對其抗氧化活性的影響，進(jìn)一步開發(fā)和利用茯苓代謝廢料。以體外模擬消化模型為處理方法研究體外模擬消化前后茯苓各部分總多酚含量的變化，研究各部分消化前后ABTS+·、DPPH·、、·OH拮抗能力。結(jié)果表明，總體抗氧化活性以茯苓代謝廢料最高，活性接近或強于陽性對照VC；與水提法作比較，茯苓各部分醇提物抗氧化活性更好，總多酚含量相對較高；體外模擬消化可以顯著提高茯苓各部分抗氧化活性，以白茯苓醇提物活性提高最為明顯，體外模擬消化增強了茯苓各部分多酚的提取效率，增加了茯苓各部分提取物對ABTS+·、DPPH·、、·OH拮抗能力；Correl函數(shù)相關(guān)性分析表明，茯苓不同部位多酚含量與以DPPH·、ABTS+·、·OH法測定的抗氧化活性高度相關(guān)，與法測定的抗氧化活性相關(guān)性一般。ABTS+·法測定的抗氧化活性與其他方法測定的活性相關(guān)性較高，該法在茯苓各部分的抗氧化活性研究中具有一定穩(wěn)定性。

茯苓不同部位具有不同的化學(xué)成分和療效，茯苓皮、白茯苓、茯神在醫(yī)學(xué)典籍中均有藥用記載，但茯苓生長后的代謝廢料均被認(rèn)為無利用價值而被丟棄，造成資源浪費和環(huán)境的污染；且松樹皮含有大量的多酚，藥用價值廣泛[16]，因此從抗氧化活性研究出發(fā)初步做了茯苓代謝廢料的應(yīng)用研究，研究結(jié)果為茯苓代謝廢料的進(jìn)一步利用提供研究基礎(chǔ)。廢物的利用是一個綜合且系統(tǒng)的工程，故其生物活性和利用開發(fā)有待進(jìn)一步探討。