肝細(xì)胞癌多組學(xué)研究進(jìn)展

莫秋燕 龔文鋒 余紅平 唐衛(wèi)中

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多步驟、多因素的復(fù)雜過程［1］。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，一些重要的信號通路在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用得以闡明，這些通路顯示出腫瘤代謝和腫瘤微環(huán)境在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要性。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)了HCC中腫瘤干細(xì)胞不同的表面標(biāo)志物，并提出除了伴隨耐藥和轉(zhuǎn)移外，腫瘤干細(xì)胞的信號通路改變和表觀遺傳修飾也參與其中［2-4］。本文將從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多維度對HCC組學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，同時進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 HCC基因組學(xué)

1.1 基因組突變

基因組突變可分為種系突變和體細(xì)胞突變。種系突變通常是遺傳的，存在于身體的所有細(xì)胞類型中。而體細(xì)胞突變通常存在于腫瘤組織或癌前組織中，并在腫瘤進(jìn)展過程中積累。在開放閱讀框的錯義基因突變可以導(dǎo)致腫瘤抑制基因功能喪失或癌基因功能獲得。此外，基因組非編碼區(qū)突變也會影響癌癥的發(fā)生風(fēng)險和進(jìn)展，因為它們可能改變基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或穩(wěn)定性。

1.1.1 種系突變 越來越多的證據(jù)表明，HCC的發(fā)生涉及遺傳易感性和環(huán)境因素［5］。在過去10余年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與HCC發(fā)病相關(guān)的易感基因位點［6］。這些易感基因多態(tài)性改變了致癌的生物途徑［7］，包括通過TNFA、IL1B或 TGFB基因引起炎癥；SOD2或MPO基因引起氧化應(yīng)激；鐵代謝基因（HFE1）與酒精攝入對C282Y突變體的協(xié)同作用；DNA修復(fù)障礙（MTHFR、XRCC3）；細(xì)胞周期改變（MDM2、TP53）等?；蚨鄳B(tài)性調(diào)節(jié)在HCC不同階段的發(fā)生風(fēng)險，包括風(fēng)險因素（如病毒性肝炎、酒精攝入或肥胖）的易感性，慢性肝病的嚴(yán)重程度及其演變?yōu)楦斡不瑦盒赞D(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展等?；蚪M中的單核苷酸變化對癌癥進(jìn)展有重要作用，被稱為突變或變異的核苷酸變化可導(dǎo)致癌基因或抑癌基因功能獲得或喪失。非編碼核苷酸的改變也會影響基因轉(zhuǎn)錄和關(guān)鍵腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而直接觸發(fā)腫瘤發(fā)生或增加癌癥發(fā)生風(fēng)險。然而，目前所有與HCC發(fā)生風(fēng)險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性還未顯示足夠的優(yōu)勢比，尚不足以作為預(yù)測指標(biāo)而被引入臨床實踐。因此，需進(jìn)一步加深對與HCC發(fā)生風(fēng)險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的研究，同時將遺傳變異與臨床特征相結(jié)合或?qū)⒏纳片F(xiàn)有的HCC風(fēng)險評估模型。

1.1.2 體細(xì)胞突變 體細(xì)胞突變在調(diào)控途徑中的累積是HCC發(fā)生的主要促進(jìn)因素。全外顯子組/基因組測序描繪了HCC的突變格局，識別了新的癌癥驅(qū)動基因和致癌途徑，目前已經(jīng)報告了HCC的50～70個非沉默突變［7-8］。大多數(shù)突變發(fā)生在乘客基因中，隨機(jī)發(fā)生，沒有功能性后果；而每個腫瘤有2～6個突變是驅(qū)動突變，對腫瘤進(jìn)化有關(guān)鍵影響［9］。驅(qū)動突變主要影響以下6個重要的生物學(xué)途徑：端粒維持、Wnt/βcatenin途徑細(xì)胞周期控制、表觀遺傳調(diào)控、氧化應(yīng)激以及AKT/mTOR和MAP激酶途徑［10］。Wnt信號通路是HCC中最常見的改變。32.8%的HCC患者存在CTNNB1激活突變，AXIN1和APC的失活突變率分別為15.2%和1.6%。HCC的第二大改變途徑是p53信號途徑。20.8%的HCC患者存在p53失活突變，8%的患者存在CDKN2A突變。除了在癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變的傳統(tǒng)信號通路，最近一些研究報道染色體重塑復(fù)合物成分在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥類型中也經(jīng)常發(fā)生突變。在超過20%的HCC患者中檢測到SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物成分ARID1A突變。提示染色質(zhì)重塑復(fù)合物可能在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外，不同研究中發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動基因突變率的差異可能反映了不同人群致病風(fēng)險因素的差異。比如，TP53的失活突變在HBV相關(guān)HCC以及暴露于黃曲霉毒素B1的患者中富集；TERT啟動子突變、CTNNB1和ARID1A失活突變與酒精性肝病患者發(fā)生HCC有關(guān)［8］。

1.2 染色體不穩(wěn)定

染色體不穩(wěn)定性是HCC最常見的遺傳改變，可能由有絲分裂過程中的錯誤或DNA復(fù)制和修復(fù)中斷引起。染色體異?？杀憩F(xiàn)為整條染色體臂的獲得和丟失，也可表現(xiàn)為染色體小片段的擴(kuò)增和缺失。最近，3個獨立的研究通過比較配對HCC樣本中全基因組和全外顯子組測序產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)評估拷貝數(shù)變異［8，11-12］。結(jié)果顯示，HCC 組織在 1q、5p、6p、8q、17q、20q 和 Xq染色體經(jīng)常擴(kuò)增，而在 1p、4p-q、6q、8p、13p-q、16p-q、17p、21p-q和22q染色體經(jīng)常丟失。染色體不穩(wěn)定性可能發(fā)生在HCC的早期，并在腫瘤進(jìn)展過程中累積。因此，染色體不穩(wěn)定性可能在HCC發(fā)生過程中激活某些癌癥驅(qū)動基因。這些熱點區(qū)域通常含有重要的癌基因或抑癌基因，HCC組織中的MET、MYC、TERT、CCND1和FGF19等癌基因常出現(xiàn)局部擴(kuò)增，而PTEN、TP53、CDKN2A和CDKN2B等抑癌基因常出現(xiàn)局部缺失，這些基因變化均對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用。

2 HCC表觀組學(xué)

表觀遺傳調(diào)控不改變基因組序列，但影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄。表觀遺傳調(diào)控在多個層面上影響基因產(chǎn)物，包括轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)增加了巨大的多樣性。DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA是基因調(diào)控的主要形式。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的改變可能導(dǎo)致基因表達(dá)中斷，也可能導(dǎo)致癌基因激活或抑癌基因失活［13］?；谙到y(tǒng)陣列和下一代基因測序的研究表明，HCC組織大量基因靶點受到基因啟動子區(qū)域異常DNA甲基化的影響，這直接增加或降低了下游基因轉(zhuǎn)錄活性［14］。

2.1 DNA甲基化

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化的DNA甲基化是DNA的一種化學(xué)修飾，通過甲基與胞嘧啶環(huán)的5′碳位結(jié)合而發(fā)生，對調(diào)節(jié)基因表達(dá)至關(guān)重要［15］。在癌癥中，腫瘤抑制基因的表達(dá)經(jīng)常被啟動子區(qū)域的CpG島高甲基化所沉默［16］。因此，DNMT上調(diào)促進(jìn)了癌癥發(fā)展［17］。研究報道DNMTs的mRNA水平，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在HCC組織中的表達(dá)均顯著高于非腫瘤性肝組織［18］。此外，DNMTs表達(dá)增加被認(rèn)為是HCC患者生存率低的預(yù)測因子［19］。迄今為止，大量研究已表明DNMT介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)改變可調(diào)控HCC轉(zhuǎn)移、侵襲和進(jìn)展［20］。

2.2 組蛋白修飾

組蛋白修飾包括組蛋白甲基化、乙?；头核鼗?，通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄水平而影響腫瘤進(jìn)展過程［21-22］。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶是研究抗癌藥物開發(fā)分子靶點的主要焦點［23］。既往文獻(xiàn)報道組蛋白甲基化與HCC轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)基因上調(diào)和下調(diào)密切相關(guān)［24-28］。為了啟動HCC轉(zhuǎn)移，各種甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶使組蛋白H3賴氨酸（K）4和K36甲基化，從而引起構(gòu)象變化，影響常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的平衡和分布，導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)基因上調(diào)。相反，這些基因通過組蛋白H3K9和K27甲基化參與異染色質(zhì)形成后EMT相關(guān)基因的下調(diào)［29］。

2.3 miRNA

miRNA表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［30-31］。最近研究表明，miRNA介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號通路異常調(diào)控可導(dǎo)致HCC發(fā)生。在HCC組織中，miR-542-3p和miR-142低表達(dá)，這兩種miRNAs通過與3′-UTR結(jié)合直接調(diào)節(jié) TGFB1轉(zhuǎn)錄物［32-33］，從而負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路，促進(jìn) EMT和癌癥轉(zhuǎn)移。既往研究報道［34］，TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 Smad7也受miRNAs調(diào)控，miR-216a/217高表達(dá)通過靶向Smad7、PTEN基因促進(jìn)EMT、細(xì)胞遷移、干細(xì)胞樣特性和肝癌復(fù)發(fā)。此外，有研究顯示，miRNAs也可以不通過Smad信號傳導(dǎo)而實現(xiàn)對TGF-β信號傳導(dǎo)下游基因的調(diào)控，如TGF-β1誘導(dǎo)的EMT被miR-300通過靶向調(diào)節(jié)EMT的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）抑制［35］。另一項研究發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p與其靶基因N-cadherin在HCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，修復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)HCC中miR-199b-5p過度表達(dá)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的AKT磷酸化，而PI3K/AKT通路的抑制可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的 N-cadherin過度表達(dá)［36］。還有研究報道m(xù)iRNAs可被TGF-β信號正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。例如，用重組TGF-β1治療可增加HCC中miR-155和miR-181a的表達(dá)水平［37-38］。這些 miRNAs通過 TGF-β信號過度表達(dá)促進(jìn)EMT，在體外用TGF-β治療后，通過阻斷E-cadherin和促進(jìn)HCC中的Snail和ZEB1也觀察到相似的表型。

3 HCC轉(zhuǎn)錄組學(xué)

高通量技術(shù)的最新進(jìn)展使大規(guī)模的基因表達(dá)譜分析成為可能，但與基因組水平上的主動全序列分析相比，基于第二代測序技術(shù)開展的HCC全轉(zhuǎn)錄組測序不多。最新開展的一項全轉(zhuǎn)錄組測序研究［39］結(jié)果顯示，除了既往研究［40-41］報道的 ALG1l、SERPINA11、TMEM82、GPC3、SPINK1 和 ESM1 表達(dá)失調(diào)外，CENPF和FOXM1等基因被發(fā)現(xiàn)是最重要的上調(diào)基因。CENPF是一種微管結(jié)合蛋白，是著絲點運動和有絲分裂分離必需的蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)丙酮酸激酶M2磷酸化信號調(diào)節(jié)癌癥代謝［42］。FOXM1是通過控制細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的叉頭框蛋白轉(zhuǎn)錄因子。最新研究顯示，甲狀腺激素通過抑制FOXM1表達(dá)抑制HCC進(jìn)展［43］。這兩種蛋白在HCC中同時上調(diào)也可能提示了潛在的功能協(xié)同作用。此外，HCC組織中C型凝集素家族的多個成員（CLEC4G、CLEC1B和CLEC4M）和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白（corticotropin-releasing hormone bind protein，CRHBP）均表達(dá)下調(diào)。C型凝集素是一種鈣依賴性多糖結(jié)合蛋白，是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體［44］。C型凝集素表達(dá)下調(diào)可能與HCC發(fā)病有關(guān)。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）也已被證明在多種癌癥中調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和血管生成［45］。CRHBP作為CRF系統(tǒng)中的一員，其缺失也可能通過類似的機(jī)制參與HCC發(fā)生。

4 HCC蛋白質(zhì)組學(xué)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多研究表明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種生物過程而在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［46］。蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)為HCC生物學(xué)研究及治療提供了新的見解。針對腫瘤和鄰近肝臟樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也進(jìn)一步揭示了HCC發(fā)生的關(guān)鍵信號通路的激活狀態(tài)以及肝臟特異性代謝重編程。目前，多種蛋白質(zhì)，如AGP1、A1AT和A2M等被報道為新的診斷生物標(biāo)志物候選者，這些蛋白質(zhì)未來可能或為HCC的治療靶點［47-50］。但是這些蛋白分子標(biāo)志物的敏感性和特異性較低，迄今為止還未發(fā)現(xiàn)對HCC完全特異的生物標(biāo)志物。因此，對HCC新的腫瘤標(biāo)志物的開發(fā)及其組合進(jìn)行研究，以提高對HCC診斷和療效評估的特異性和敏感性尤為迫切。

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）與多種致癌信號通路激活有關(guān)，包括PI3K/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶、Wnt/β-catenin信號和TGF-β誘導(dǎo)的EMT通路［51］。最近兩項研究顯示，F(xiàn)ASN在HCC組織和細(xì)胞中過表達(dá)，且可能通過影響EMT和MMPs的功能參與調(diào)控HCC侵襲和轉(zhuǎn)移［52-53］。進(jìn)一步研究顯示，抑制FASN可降低IGFBP1和HIF-1α的表達(dá)進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲［52］，顯示了FASN成為HCC治療靶標(biāo)的巨大潛力。此外，一項HBV相關(guān)HCC的蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，PYCR2和ADH1A是潛在的HCC預(yù)后預(yù)測生物標(biāo)志物［54］。多項研究也報道PYCR2在多種癌癥類型中均上調(diào)，且其上調(diào)可使腫瘤細(xì)胞能夠應(yīng)對代謝增強(qiáng)而產(chǎn)生的過多氧化物，并可能推動腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［55-56］。另有研究發(fā)現(xiàn)PYCR2缺失可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激而觸發(fā)細(xì)胞凋亡［57］。ADH1A主要存在于肝臟，可以把攝入體內(nèi)的乙醇轉(zhuǎn)化為致癌代謝物乙醛；ADH1A濃度下調(diào)會引發(fā)體內(nèi)乙醇聚積，從而增強(qiáng)酒精誘導(dǎo)的肝損傷和癌變［58］。還有研究顯示，ADH1A可以有效預(yù)測HCC發(fā)生和進(jìn)展，其中較高的ADH1A表達(dá)水平與HCC患者較高的生存率及較低的侵襲性相關(guān)［59］。

5 HCC代謝組學(xué)

眾所周知，癌細(xì)胞經(jīng)歷代謝重編程以維持腫瘤發(fā)生和細(xì)胞增殖的代謝需要。癌癥中最廣為人知的代謝變化發(fā)生在中心代謝中，隨著有氧葡萄糖代謝的增加，細(xì)胞葡萄糖輸入增加，從而產(chǎn)生ATP和乳酸，這一過程稱為“Warburg效應(yīng)”［60］。另一個重要的代謝變化是谷氨酰胺攝取增加，這表明谷氨酰胺攝取增加發(fā)生在NADPH合成等重要途徑中，并作為非必需氨基酸和核苷酸生物合成中的氮源［61］。癌癥通常會引起顯著的代謝改變以維持其生長，而代謝組學(xué)使癌癥的早期診斷成為可能。此外，這些代謝變化還可導(dǎo)致代謝物驅(qū)動的基因調(diào)控和與腫瘤微環(huán)境的代謝相互作用發(fā)生改變，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展和侵襲性。

肝臟是人體的代謝中樞，能調(diào)節(jié)許多代謝物的表達(dá)水平，因此代謝組學(xué)分析方法尤其適用于肝臟疾病研究。近年來對HCC組織的研究報道了許多不同的代謝物，提示在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的代謝變化，尤其是與正常肝功能相關(guān)基因的下調(diào)，如藥物/異源代謝和氨基酸代謝［62-65］。目前的研究的一個共同發(fā)現(xiàn)是HCC的糖酵解表型［66-67］，表明HCC中可能發(fā)生“Warburg效應(yīng)”。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，該通路在多種腫瘤類型中被上調(diào)，并被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的中心驅(qū)動因素。目前臨床上的激酶抑制劑，如索拉非尼和厄洛替尼都是通過阻斷MAPK/ERK途徑發(fā)揮作用。既往研究也證實，ERK通路在HCC中被高度激活并與耐藥相關(guān)［68］。新近的一項研究結(jié)果顯示，谷氨酰胺缺乏會觸發(fā)HCC細(xì)胞嚴(yán)重的代謝改變和ERK通路激活，當(dāng)新陳代謝嚴(yán)重改變時，阻斷pERK會導(dǎo)致新陳代謝重編程并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［69］。這一發(fā)現(xiàn)為臨床上理解HCC激酶抑制劑耐藥以及根據(jù)患者代謝受損情況決定是否使用激酶抑制劑提供了有力證據(jù)。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，在多個分子水平上探討HCC的發(fā)生可為其治療提供線索，識別關(guān)鍵的分子事件和信號傳導(dǎo)途徑也為HCC的靶向療法提供依據(jù)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀組學(xué)及腫瘤免疫分析地結(jié)合將進(jìn)一步提高對HCC發(fā)生分子機(jī)制的理解，推動HCC精準(zhǔn)醫(yī)療進(jìn)程。HCC多組學(xué)的研究提高了對HCC復(fù)雜性的認(rèn)識，但也仍有許多問題有待探索。值得注意的是，大多數(shù)探索HCC異質(zhì)性的研究都單純分析了手術(shù)標(biāo)本，而不是需要全身治療的晚期腫瘤。此外，對腫瘤進(jìn)行單次活檢取樣可能會限制特定腫瘤區(qū)域的靶向亞克隆改變的識別。但是有理由相信，隨著技術(shù)的發(fā)展，使用液體活組織檢查或其他技術(shù)對腫瘤進(jìn)行分類的能力將越來越強(qiáng)大，對疾病的分子理解也將更加深入和全面，從而將對疾病的分子理解納入治療決策中；這些數(shù)據(jù)還有助于解析免疫療法的耐藥機(jī)制，并指導(dǎo)個性化用藥，最終實現(xiàn)將腫瘤的基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床實踐，改善患者的臨床預(yù)后。