骨發(fā)育及損傷修復過程中骨形成與血管形成的偶聯(lián)作用

胡灝 王任先 萬奔 鄒學農(nóng)

骨組織是成分復雜的結(jié)締組織，其無機成分占了干重的 65%，主要由羥基磷灰石結(jié)晶構(gòu)成，這決定了骨的硬度；骨的有機成分占干重的 35%，主要由 Ⅰ 型膠原纖維構(gòu)成，為骨組織提供了強大的韌性[1]。相比難以再生的心臟、腦組織等，骨組織具有極強的再生修復能力，這是因為其內(nèi)外膜下以及骨髓腔內(nèi)存在骨骼系統(tǒng)特異的干細胞或成骨前體細胞[2-3]?？此浦旅艿墓墙M織實際上是血液供應(yīng)非常豐富的組織，以長骨為例，較大的動脈由長骨中段穿過骨外膜，隨后逐級分成細小的分支，通過骨組織中微小的管道，最終形成直徑約為 5～10 μm 毛細血管床，滋養(yǎng)著藏匿骨中的骨細胞、干細胞、成骨細胞、破骨細胞等細胞組分[4]。

骨組織是功能活躍的組織，由成骨細胞與破骨細胞分別領(lǐng)導的成骨活動與破骨活動維持著骨的穩(wěn)態(tài)。新骨的形成需要通過血管提供營養(yǎng)，舊骨分解代謝的產(chǎn)物同樣需要通過血管的運輸，骨組織中的血管為其穩(wěn)態(tài)維持提供堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。在骨的形成過程中，血管形成是不可或缺的重要環(huán)節(jié)，筆者將從骨發(fā)育以及骨損傷后修復兩個角度對血管形成在骨形成中的作用進行概述，并從內(nèi)皮細胞類型、細胞外生長因子、細胞內(nèi)信號通路等多個層次闡述骨形成與血管形成的偶聯(lián)作用機理。

一、骨發(fā)育中骨形成與血管形成的偶聯(lián)

在胚胎發(fā)育的過程中，骨的形成有兩種方式，即軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨。對于大多數(shù)骨而言，尤其是長骨，骨的形成是以軟骨內(nèi)成骨的方式產(chǎn)生的，而少數(shù)的骨 (如顱骨、頜面骨與鎖骨部分區(qū)域) 是通過膜內(nèi)成骨的方式發(fā)生的。無論何種骨形成方式，骨的最初形態(tài)、輪廓都是由無血管的間充質(zhì)細胞團構(gòu)成，但其周圍的疏松間充質(zhì)組織內(nèi)，許多毛細血管呈蓄勢長入的狀態(tài)，等待缺氧信號的號召。

1. 軟骨內(nèi)成骨與血管形成：軟骨內(nèi)骨形成大約發(fā)生在胚胎時期的 10.5 天，間充質(zhì)細胞團通過增殖與有序排列獲得了骨的初步幾何形狀。隨著間充質(zhì)細胞團向外擴張，中央?yún)^(qū)域的間充質(zhì)細胞開始分化成軟骨細胞。到了胚胎的 13.5 天，擴張至外周的軟骨細胞由于接觸到疏松間充質(zhì)組織中的毛細血管開始分化為成骨細胞，形成一圈骨領(lǐng)結(jié)構(gòu)，而中央?yún)^(qū)域的軟骨細胞由于氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足而肥大化[6]。肥大化的軟骨細胞進一步發(fā)生凋亡，對血管長入以及后續(xù)的骨形成過程有著非常關(guān)鍵的調(diào)控作用。Gerber 等[7]發(fā)現(xiàn)，相比靜息軟骨細胞與增殖型軟骨細胞，肥大軟骨細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 的表達量非常高，而其凋亡后，可在局部釋放大量的 VEGF，作為強大的刺激因子，介導了血管內(nèi)皮細胞的生長和血管的侵入。在這個過程中，血管經(jīng)過骨領(lǐng)侵入間充質(zhì)細胞團的中央?yún)^(qū)域，并將骨領(lǐng)中的成骨細胞以及循環(huán)血液中的單核 / 巨噬細胞帶入其中。成骨細胞持續(xù)產(chǎn)生 Ⅰ 型膠原等細胞外基質(zhì)，構(gòu)成了初級骨化中心，而來到局部的巨噬細胞在將凋亡細胞清除后，可分化為破骨細胞，與成骨細胞一起進行骨的動態(tài)重 塑[8]。關(guān)于肥大軟骨細胞內(nèi) VEGF 的表達升高的原因，有學者發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)來源的細胞可以感受局部組織缺氧的信號，進而激活細胞內(nèi)缺氧的信號通路，導致缺氧誘導因子 (hypoxia-inducible factor，HIF) 的表達升高，進而作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游適應(yīng)缺氧的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，其中就包括 VEGF 等多種促血管因子[9-10]。

2. 膜內(nèi)成骨與血管形成：關(guān)于膜內(nèi)成骨的研究大多是針對額骨和頂骨進行的[11]。以顱蓋骨為例，起初間充質(zhì)細胞團聚集，形成薄層穹頂樣的形狀，其基底部則圍繞著有毛細血管的疏松間充質(zhì)組織。隨著間充質(zhì)細胞團的擴張，其內(nèi)可能存在缺氧因素而導致 VEGF 等促血管形成的因子分泌，這對基底部的疏松間充質(zhì)組織中的毛細血管起到招募作用[12]。隨著血管侵入，在缺氧狀態(tài)改善的情況下，一部分間充質(zhì)細胞分化成了成骨細胞。最開始血管侵入的部分隨后成為了骨化的中心，隨著間充質(zhì)細胞團向外延伸，血管也呈放射狀輻射出去。成骨細胞靠近血管分布，因而產(chǎn)生的膠原纖維及礦化骨質(zhì)也從一個區(qū)域中心，呈放射狀輻射出去，高分辨 CT 及雙光子激光掃描顯微鏡的掃描研究證實了這一現(xiàn)象[13]。

相比于軟骨內(nèi)成骨，膜內(nèi)成骨最大的特點是骨形成的過程中沒有軟骨細胞增殖、肥大化與凋亡的過程。而兩種骨形成模式非常相似的一點是缺氧狀態(tài)所導致 VEGF 的表達與血管侵入。相似中卻有不同的是，有學者發(fā)現(xiàn)， HIF-2α 在兩種骨形成方式中均存在，而 HIF-1α 僅僅在軟骨內(nèi)骨形成中被檢測到[14]。Wang 等進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，增加 HIF-1α 的表達可以增加長骨的長度，而對顱骨并沒有影響，這表明缺氧對兩種骨形成方式的影響不是一致 的[15]。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，缺氧不是惟一的促進促血管形成因子表達的因素，在骨形成過程中升高表達的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)[16]以及成纖維生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)[17]也能上調(diào) VEGF 的表達。

二、骨損傷修復與血管形成

在骨損傷修復的過程中，研究者們常采用分離性骨生成的模型來研究血管形成在其中扮演的角色[18]。在骨分離的最初階段，分離區(qū)域由于組織炎癥的影響產(chǎn)生了血腫包裹的纖維愈傷組織。當分離的拉力施加上時，中央形成了一個由纖維樣細胞、軟骨樣細胞及中間形態(tài)細胞構(gòu)成的無血管的中央纖維間區(qū)(Choi)。血管從兩個骨折斷端向中間長入，到達中央纖維間區(qū)兩端而停止，形成平行于骨長軸的多條血竇，同時長柱狀的類骨質(zhì)也沿著血管產(chǎn)生。隨著骨分離的停止，血管會長入中央纖維間區(qū)，并在成骨細胞與破骨細胞相互作用下完成骨的重塑[19]。在分離的骨中間，是血液供應(yīng)的真空區(qū)域，這與骨發(fā)育過程的間充質(zhì)團類似，缺氧的同時，壞死組織會釋放 VEGF 等促血管生成因子招募血管的長入[20]。對分離性骨生成的大鼠模型施加血管形成抑制劑會導致骨不連，并且在分離的骨中間檢測不到血管形成與骨形成的跡象[21]。這表明，在骨的損傷修復過程中，血管形成同樣受到缺氧信號的調(diào)控，并對骨生成起到不可缺少的作用。而與骨發(fā)育過程不同的是，骨損傷區(qū)域的壞死組織還會產(chǎn)生許多炎癥因子，其引發(fā)的免疫趨化效應(yīng)會吸引許多免疫細胞到局部發(fā)揮功能，這提示免疫細胞可能在骨損傷修復過程中對成骨成血管偶聯(lián)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[22]。

三、骨組織中的血管內(nèi)皮細胞類型

許多證據(jù)顯示，由于局部微環(huán)境不同，血管內(nèi)皮細胞在不同組織中有不同的分化表型[23-24]。Kusumbe 等[25]發(fā)現(xiàn)，根據(jù) CD31 表達的高低，骨組織中的血管內(nèi)皮細胞可分為 CD31 高表達的 H 型和 CD31 低表達的 L 型。H 型血管內(nèi)皮細胞分布在骨骺端和骨干段靠近密質(zhì)骨的骨內(nèi)膜區(qū)域，呈管束狀排列，平行于骨的長軸，而 L 型血管內(nèi)皮排列成網(wǎng)狀，分布于骨干區(qū)域，二者在近生長板的區(qū)域相互交聯(lián)。H 型血管的周圍圍繞著分泌 Ⅰ 型膠原的骨祖細胞，而在 L 型血管則包繞著造血干細胞，周圍幾乎沒有骨祖細胞。通過比較衰老小鼠和青年小鼠骨中兩種血管內(nèi)皮的差異，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠的 H 型血管內(nèi)皮細胞數(shù)量隨年齡增長顯著下降，與骨量的下降呈相同趨勢，而 L 型血管內(nèi)皮細胞數(shù)量與青年小鼠沒有顯著差異。應(yīng)用抗骨質(zhì)疏松藥物或促 H 型血管的藥物進行治療，可觀察到骨組織的骨量和 H 型血管內(nèi)皮細胞均顯著增加[26-28]。以上實驗表明了 H 型血管是骨形成和血管形成偶聯(lián)機制的效應(yīng)血管。

緊接著，Langen 等[29]使用流式細胞術(shù)進一步深入分析了胚胎 16.5 天、出生 0 天、6 天、14 天小鼠的血管內(nèi)皮細胞表型，發(fā)現(xiàn)在 H 型血管中還可以分出一群高表達 Emcn 的 E 型血管。在胚胎 16.5 天，E 型血管所占比例非常高(56%)，出生后比例不斷下降；H 型血管內(nèi)皮細胞的比例則是先升后降，在出生后 6 天達到高峰，而隨著年齡增大而下降；L 型血管所占比例隨年齡持續(xù)增加?；虮磉_譜系分析發(fā)現(xiàn)，E 型血管內(nèi)皮細胞可能是 H 型血管內(nèi)皮細胞的祖細胞，而一部分 H 型血管隨著年齡增長又演變成了 L 型血管。盡管研究表明 E 型血管內(nèi)皮細胞可能是其它兩類內(nèi)皮細胞的祖細胞，但它的特性、定位以及功能還需要進一步的研究。這也提示在組織工程的研究中，特異性地篩選 H 型血管參與組織構(gòu)建，增強組織血管形成能力，或?qū)⒊蔀樾碌难芯口厔荨?/p>

四、在骨形成與血管形成偶聯(lián)中發(fā)揮作用的細胞因子

在過去的研究中，被提到最多的、并且被認為最重要的影響骨形成與血管形成偶聯(lián)的細胞因子即為 VEGF[20,30]。其 VEGF-A 亞型是調(diào)控血管形成的主要因子，由于血管內(nèi)皮細胞為血管形成過程中的細胞執(zhí)行者，它的表面有血管內(nèi)皮生長因子受體 R2，當二者發(fā)生結(jié)合，引發(fā)的信號會促進血管內(nèi)皮細胞的遷移與增殖。在軟骨內(nèi)成骨的過程中，由于軟骨細胞缺氧而發(fā)生肥大化，進而分泌大量 VEGF-A，周圍已存在的血管網(wǎng)便迅速發(fā)生新生血管，侵入軟骨中，引發(fā)骨的形成過程。當抑制 VEGF 活性時，由于血管的侵入受到抑制，肥大的軟骨細胞區(qū)域出現(xiàn)代償性擴大(為了產(chǎn)生更多的 VEGF)。隨后，有研究對 VEGF 的治療效果進行驗證，發(fā)現(xiàn)無論是在軟骨內(nèi)成骨還是膜內(nèi)成骨過程中，應(yīng)用 VEGF 能強化血管形成與骨形成的能力[30-31]。

血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF) 是間充質(zhì)來源細胞的一種潛在絲裂原，在血管形成過程中發(fā)揮重要作用。Xie 等[32]的研究表明，前破骨細胞分泌的 PDGF-BB 能促進血管形成，并與骨形成的過程發(fā)生偶聯(lián)。前破骨細胞敲除 PDGF-BB 后，小鼠的骨量明顯下降，同時 H 型血管和正常小鼠比也明顯減少。在骨質(zhì)疏松小鼠模型中，血清和骨髓中的 PDGF-BB 以及 H 型血管都是明顯減少的，而使用外源性的 PDGF-BB 可以增加 H 型血管并刺激骨質(zhì)疏松小鼠的骨形成。在骨形成的過程中，前破骨細胞是血管侵入后進入骨中的，而它分泌的 PDGF-BB 能夠促進 H 型血管的生成，這表明血管生成在骨生成過程中存在一個正反饋的機制。全身應(yīng)用 PDGF-BB 早已被證實能促進骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度[33]，而將 PDGF-BB 結(jié)合生物材料植入大鼠顱骨缺損可以獲得很好的骨修復效果[34]。在人類臨床試驗研究中，人重組 PDGF-BB 與修復支架聯(lián)合局部應(yīng)用，可以促進牙槽骨生成與填充，提高臨床附著水平(clinical attachment level，CAL)[35]。

一項針對新西蘭大白兔骨缺損治療的研究中，比較了單獨應(yīng)用 VEGF 與含有多種因子(VEGF、PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子等) 的血小板基質(zhì)的療效，結(jié)果顯示，相比單用血管生長因子，多種因子的共同作用可以獲得更佳的骨修復效果[36]。如何進一步篩選出最優(yōu)的細胞因子組合、配比，以增強骨修復、降低副作用，對于將研究成果推向臨床至關(guān)重要。

五、Notch 信號通路在骨生成、血管生成偶聯(lián)中的 作用

Notch 信號通路是一條在進化上高度保守，影響細胞增殖、分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑，可通過介導細胞間相互作用調(diào)控胚胎發(fā)育、組織更新和腫瘤發(fā)生[37]。在胚胎發(fā)育、小鼠視網(wǎng)膜或腫瘤中，Notch 信號被認為是負面調(diào)控血管生成的[38]，抑制內(nèi)皮細胞 Notch 信號的激活可引起內(nèi)皮細胞增殖和大量出芽，導致軟組織的過度血管化。然而，在出生后的長骨中，Notch 信號是促進內(nèi)皮細胞增殖與血管生成的，這與其在其它器官與腫瘤中的作用相 反[39]。內(nèi)皮細胞特異性的 Notch 信號通路擾亂不僅損害血管形態(tài)和生長，而且會造成骨形成的減少，長骨長度縮短，軟骨細胞缺陷，皮質(zhì)骨丟失以及骨量減少。抑制 Notch 信號中的一個重要介導基因 Rbpj，出生后小鼠的骨中 H 型血管以及長骨中增殖的內(nèi)皮細胞明顯減少。而通過表達 Fbxw7 基因來加強 Notch 信號通路的作用，可發(fā)現(xiàn)盡管小鼠視網(wǎng)膜血管生成減少了，但是小鼠骨中增殖內(nèi)皮細胞含量更多了，同時骨量也有顯著的提高[40]。另外，Notch 信號也會影響 VEGF 及其受體的表達，抑制 Notch 信號導致 VEGF 受體 1、2、3 均下調(diào)。相反，強化 Notch 信號會導致上述受體的表達增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些骨骼缺陷與內(nèi)皮細胞 Noggin 自分泌不足有關(guān)。Noggin 作為 BMPs 的抑制劑，由 Notch 信號調(diào)控內(nèi)皮細胞分泌，能促進肥大軟骨細胞的生成。這些研究表明，Notch 在骨中的血管生成發(fā)揮著重要的正性調(diào)控作用，與其在其它器官中發(fā)揮抑制性的功能完全不同。骨微環(huán)境的特別之處在于內(nèi)皮細胞與成骨細胞、破骨細胞及免疫細胞有密切的接觸與交流，Notch 信號對內(nèi)皮細胞的抑制作用是否來源于上述細胞的負反饋信號，非常值得深入的研究。

六、小結(jié)與展望

血管作為運輸氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝廢物的器官，幾乎在所有組織器官的發(fā)育及損傷后修復過程中發(fā)揮重要作用。但是，血管生成在骨組織中有多層次的獨到之處。首先，根據(jù)血管內(nèi)皮細胞 CD31 及 Emcn 的表達，在骨組織中的血管內(nèi)皮細胞可分為 E 型、H 型、L 型：E 型血管內(nèi)皮可能為后兩者的祖細胞，H 型血管與骨祖細胞在空間上緊密相接，在骨形成過程中承擔血管生成的作用，而 L 型血管與造血干細胞的關(guān)系更為密切[41]。其次，缺氧-HIFVEGF 的調(diào)控軸是血管化的主要刺激因素[42]，但是在軟骨內(nèi)成骨與膜內(nèi)成骨中，缺氧的重要性與表象又有不同。此外，在骨組織中，調(diào)控血管生成的信號通路又是非常特別的，與其它器官中 Notch 信號通路的抑制性調(diào)控不同，骨組織中 Notch 信號正向調(diào)控血管生成，并與骨形成的過程相偶聯(lián)。

在骨的發(fā)育或者是損傷后的修復過程中，血管形成先于骨形成，是必不可少的環(huán)節(jié)，以促血管生成為思路的治療手段在骨質(zhì)疏松或骨缺損，在動物模型中取得了很好效 果[43-44]，如果進一步將該理念應(yīng)用于臨床研究，將帶來新的研究熱點與研究機遇。此外，新一代的骨修復材料需要被賦予更強大的生物活性，對于骨修復材料的生物學評價而言，將促血管生成的能力納入評價體系更有利于篩選出與體內(nèi)環(huán)境適配的新型骨修復材料。

盡管研究人員對于骨形成與血管形成的偶聯(lián)作用有了較為清晰的認識，但仍然有一些懸而未決的科學問題需要深入的研究。比如，在長骨發(fā)育過程中，血管的長入讓大部分間充質(zhì)團經(jīng)歷了軟骨內(nèi)成骨的過程，而長骨兩端卻始終維持無血管的透明軟骨狀態(tài)，其抑制成骨與成血管偶聯(lián)的機制是什么尚無定論?，F(xiàn)階段關(guān)于成骨成血管調(diào)控的分子機制仍不完善，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞中 miR-140-5p 的上調(diào)和 miR-146b 的下調(diào)分別通過靶向 VEGFα 和 Smad4 抑制血管化，進而維持軟骨表型[45]。在此筆者提出，當發(fā)育或者組織損傷的信號出現(xiàn)時，包括 microRNA 在內(nèi)的多種表觀遺傳調(diào)控機制對成骨成血管偶聯(lián)的過程進行精妙的正向與反向調(diào)控。深入探究血管形成和骨形成偶聯(lián)過程中的表觀遺傳機制將有助實現(xiàn)對骨發(fā)育和修復過程的精準調(diào)控，最終為骨質(zhì)疏松、骨腫瘤等多種骨軟骨相關(guān)疾病的治療提供新的思路與手段。